何水林版基因工程第五章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定-全文預(yù)覽
【正文】 、載體表型選擇法 二、根據(jù)插入基因的表型選擇 三、 DNA電泳檢測法 四、 PCR檢測法 五、核酸雜交檢測法 六、免疫化學(xué)檢測法 七、 DNA序列分析 第三節(jié) 重組子的篩選與鑒定 1. 抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗性基因 : Tetr和 Ampr。 4. DEAE葡萄糖轉(zhuǎn)染法 三、轉(zhuǎn)化率及影響因素 轉(zhuǎn)化率 （ cfu / μgDNA） ： 每微克重組 DNA轉(zhuǎn)化后 ， 接納 DNA分子的受體細(xì)胞的個(gè)數(shù) ， 即陽性克隆數(shù) 。 2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 脂質(zhì)體包埋 DNA，通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。 與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。 （一）轉(zhuǎn)化（ transformation） （ 1）熱激法（ heat shock） （ 2）電轉(zhuǎn)化法（ electronporation） （ 3） PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 （ 4）接合轉(zhuǎn)化 制備感受態(tài)細(xì)胞 增加受體菌細(xì)胞膜的通透性 （ 1）熱激法 ① 目的 感受態(tài)細(xì)胞： 處于能吸收外源 DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞 制備感受態(tài)細(xì)胞 將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌置于 0℃ 的 CaCl2低滲溶液中 ， 細(xì)胞膨脹成球形 ， 處于感受態(tài)； 將感受態(tài)細(xì)胞與 DNA混合 ， Ca2+與 DNA結(jié)合形成抗 DNase的羥基 磷酸鈣復(fù)合物 ， 粘附于細(xì)胞表面； 經(jīng) 42℃ 短時(shí)間熱激處理 ， 細(xì)胞吸收 DNA復(fù)合物； 在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時(shí)之后 ， 球形細(xì)胞復(fù)原并增殖 。 帶酶切位點(diǎn)的 PCR產(chǎn)物 GCAGAATTC PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CCTAGGCGC PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CGTCTTAAG GGATCCGCG EcoR I位點(diǎn) BamH I位點(diǎn) AATTC PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CCTAG PCR產(chǎn)物 5’ 3’ G G EcoR I BamH I 兩頭各有一個(gè)粘性末端！ A A dNTP T T dTTP Taq DNA聚合酶 載體 PCR產(chǎn)物 TA TA 三、 PCR產(chǎn)物的連接 2. 與 T載體直接連接 三、 Gateway 載體構(gòu)建系統(tǒng) ?噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)； 高效的實(shí)現(xiàn) DNA序列在多種載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。 ③ 缺點(diǎn)： 先用小牛腸 堿性磷酸酶 （ CIP） 處理接頭 ， 水解掉其5’端的磷酸 ， 防止自我連接 。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ OH OH P P P P HO HO 5’ 3’ OH P P HO 5’ 3’ 二、平末端（ blunt end）的連接 （ 1）同聚加尾法 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉(zhuǎn)移酶 能在沒有模板的情況下給 DNA的 3’OH端 加上脫氧核苷酸。 （一） 直接連接 T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的 1~10%。 非酶切位點(diǎn) （ 2）銜接物（ linker）連接 Linker： 用化學(xué)合成法合成的一段 1012bp的，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的 平末端雙鏈寡核苷酸 GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker： （二） 人工加尾形成 “粘性末端” （ 1）多核苷酸激酶處理 （ 2） T4連接酶連接 （ 3）限制性內(nèi)切酶消化 （ 4）目的片段與載體連接 （二） 人工加尾形成 “粘性
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