何水林版基因工程第五章基因的轉移與重組體的篩選和鑒定-全文預覽
【正文】 、載體表型選擇法 二、根據(jù)插入基因的表型選擇 三、 DNA電泳檢測法 四、 PCR檢測法 五、核酸雜交檢測法 六、免疫化學檢測法 七、 DNA序列分析 第三節(jié) 重組子的篩選與鑒定 1. 抗藥性標記及其插入失活選擇法 pBR322質粒上有兩個抗性基因 : Tetr和 Ampr。 4. DEAE葡萄糖轉染法 三、轉化率及影響因素 轉化率 （ cfu / μgDNA） ： 每微克重組 DNA轉化后 ， 接納 DNA分子的受體細胞的個數(shù) ， 即陽性克隆數(shù) 。 2. 脂質體介導法 脂質體包埋 DNA，通過細胞膜進入細胞。 與轉化無本質區(qū)別 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。 （一）轉化（ transformation） （ 1）熱激法（ heat shock） （ 2）電轉化法（ electronporation） （ 3） PEG介導的原生質體轉化 （ 4）接合轉化 制備感受態(tài)細胞 增加受體菌細胞膜的通透性 （ 1）熱激法 ① 目的 感受態(tài)細胞： 處于能吸收外源 DNA分子的生理狀態(tài)的細胞 制備感受態(tài)細胞 將處于對數(shù)生長期的細菌置于 0℃ 的 CaCl2低滲溶液中 ， 細胞膨脹成球形 ， 處于感受態(tài)； 將感受態(tài)細胞與 DNA混合 ， Ca2+與 DNA結合形成抗 DNase的羥基 磷酸鈣復合物 ， 粘附于細胞表面； 經(jīng) 42℃ 短時間熱激處理 ， 細胞吸收 DNA復合物； 在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時之后 ， 球形細胞復原并增殖 。 帶酶切位點的 PCR產(chǎn)物 GCAGAATTC PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CCTAGGCGC PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CGTCTTAAG GGATCCGCG EcoR I位點 BamH I位點 AATTC PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CCTAG PCR產(chǎn)物 5’ 3’ G G EcoR I BamH I 兩頭各有一個粘性末端！ A A dNTP T T dTTP Taq DNA聚合酶 載體 PCR產(chǎn)物 TA TA 三、 PCR產(chǎn)物的連接 2. 與 T載體直接連接 三、 Gateway 載體構建系統(tǒng) ?噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)； 高效的實現(xiàn) DNA序列在多種載體系統(tǒng)的轉移。 ③ 缺點： 先用小牛腸 堿性磷酸酶 （ CIP） 處理接頭 ， 水解掉其5’端的磷酸 ， 防止自我連接 。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ OH OH P P P P HO HO 5’ 3’ OH P P HO 5’ 3’ 二、平末端（ blunt end）的連接 （ 1）同聚加尾法 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉移酶 能在沒有模板的情況下給 DNA的 3’OH端 加上脫氧核苷酸。 （一） 直接連接 T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的 1~10%。 非酶切位點 （ 2）銜接物（ linker）連接 Linker： 用化學合成法合成的一段 1012bp的，具有一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別位點的 平末端雙鏈寡核苷酸 GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker： （二） 人工加尾形成 “粘性末端” （ 1）多核苷酸激酶處理 （ 2） T4連接酶連接 （ 3）限制性內(nèi)切酶消化 （ 4）目的片段與載體連接 （二） 人工加尾形成 “粘性
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