過(guò)氧化物酶(pod)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳(編輯修改稿)
2024-09-14 17:05 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 較小，通過(guò)選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好地分離。分離膠又分為均一膠和梯度膠。（2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。本實(shí)驗(yàn)采用堿性系統(tǒng)。（3）在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。在這三種效應(yīng)的共同作用下，待測(cè)物質(zhì)被很好地分離開(kāi)來(lái)。下面以本實(shí)驗(yàn)要分離的豆芽或土豆過(guò)氧化物酶同工酶為例，分別說(shuō)明三種效應(yīng)的作用：（1）電荷效應(yīng)：各種酶蛋白按其所帶電荷的性質(zhì)及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。（2）分子篩效應(yīng)：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過(guò)程中受到阻力較小，移動(dòng)較快；反之，分子量大、形狀不規(guī)則的分子，電泳過(guò)程中受到的阻力較大，移動(dòng)較慢。這種效應(yīng)與凝膠過(guò)濾過(guò)程中的情況不同。（3）濃縮效應(yīng)：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會(huì)被壓縮成層，而使原來(lái)很稀的樣品得到高度濃縮。其原因如下：① 由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。使得在該界面處的待分離酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。② 在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是TrisHCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH ，下層分離膠為pH 。HCl是強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl－布滿整個(gè)膠板。待分離的酶蛋白樣品加在樣品槽中。電泳一開(kāi)始，遷移率最大的Cl－迅速跑到最前邊，成為快離子（前導(dǎo)離子）?！?％的甘氨酸（pI = ）遷移率最低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。，其遷移率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。由于快離子快速向前移動(dòng)，在其原來(lái)停留的那部分地區(qū)成了低離子濃度區(qū)，即低電導(dǎo)區(qū)。因?yàn)殡娢惶荻萔、電流強(qiáng)度I和電導(dǎo)率S之間有如下關(guān)系：V＝I/S (4)所以在電流恒定條件下低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度。這種在電泳開(kāi)始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追趕快離子。本來(lái)夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個(gè)追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。這就是所謂的濃縮效應(yīng)。當(dāng)酶蛋白和慢離子都進(jìn)入分離膠后，甘氨酸解離度劇增，遷移率迅速加大，從而趕上并超過(guò)所有酶蛋白分子。此時(shí)，快慢離子的界面跑到被分離的酶蛋白之前，不連續(xù)的高電位梯度不再存在。于是，此后的電泳過(guò)程中，酶蛋白在一個(gè)均一的電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而被分離。與連續(xù)系統(tǒng)相比，不連續(xù)系統(tǒng)的分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。過(guò)氧化物酶同工酶電泳同工酶是指其催化的化學(xué)反應(yīng)相同，而酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫性質(zhì)不同的一組酶。植物在發(fā)育過(guò)程中，所含同工酶的種類(lèi)和比例都不相同，它們與植物的遺傳、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定關(guān)系，因此作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，測(cè)定同工酶譜是認(rèn)識(shí)基因存在和表達(dá)的一種工具，在植物的種群、發(fā)育及雜交遺傳的研究中有重要的意義。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素
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