細胞破碎技術(shù)(編輯修改稿)
2024-09-11 20:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎 劇烈 適中 細胞懸浮液大規(guī)模處理 珠磨破碎法 細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎 劇烈 便宜 細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理 超聲波法 用超聲波的空穴作用使細胞破碎 適中 昂貴 細胞懸浮液小規(guī)模處理 研磨法 細胞被研磨物磨碎 適中 便宜 勻漿法(片型 ) 細胞被攪拌器劈碎 適中 適中 動物組織及動物細胞 不同機械破碎方法的比較 31 非機械破碎方法 酶溶破碎法（ enzyme lysis） 化學(xué)破碎法（ chemical treatment） 去垢劑破碎法（ detergents） 滲透壓沖擊破碎法（ osmotic shock） 凍融破碎法（ freezing and thawing） 32 二 非機械法 非機械方法很多 1 酶解 2 化學(xué)法溶胞 3 物理法 n 滲透壓沖擊 n 凍結(jié)和融化 n 干燥法 其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣 。 二 33 1 酶解 （酶溶法 Enymatic lysis) 酶解 是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。 1）外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶、 β1， 3葡聚糖酶、 β1， 6葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽鍵內(nèi)切酶、 殼多糖酶等 34 外加酶法 n 酶解法的特點是 專一性強 ，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來選擇。 ? 溶菌酶（ lysozyme)能專一性地分解細胞壁上 肽聚糖分子的β 1,4糖苷鍵 ，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑 EDTA一起使用。 ? 放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶， ? 酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。 ? 植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。 35 外加酶法 有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入時需確定相應(yīng)的次序。 對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì) 甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。 36 酶解法的特點 優(yōu)點： ?發(fā)生酶解的條件溫和 ?能選擇性地釋放產(chǎn)物 ?胞內(nèi)核酸等泄出量少，細胞外形較完整 缺點： ?溶酶價格高， ?溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶 ) ?產(chǎn)物抑制的存在。 37 酶解 自溶作用 ? 自溶作用是酶解的另一種方法， 利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶 。 ? 在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。 ? 自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。 ? 缺點是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。 38 某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。 2 化學(xué)滲透法 （ Chemical permeation） 該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。 39 n 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用 6mol/L HCl。 n 堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。 成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。 （ 1）酸、堿處理法 40 細胞破碎常用的表面活性劑： 十二烷基硫酸鈉（ SDS，陰離子型）；。 非離子型如 Triton X100和吐溫（ Tween）等 對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。 （ 2）表面活性劑 無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用， 能與細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解 41 能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。 有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （ 3）有機溶劑 （ 4） EDTA螯合劑 處理 G細菌，對細胞壁外層有破壞作用。 G細菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子 Ca2+或 Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦 EDTA將 Ca2+或 Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。 42 ?通用性差； ?時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過 50%； ?有些化學(xué)試劑有毒。 ?化學(xué)試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難， 并影響最終產(chǎn)物純度 化學(xué)滲透法特點： 缺點 ?對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)； ?細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。 優(yōu)點 43 3 物理法 ?滲透壓沖擊法 ?凍結(jié) 融化法 ?干燥法 44 1）滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法， 將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當(dāng)達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。 45 2）凍結(jié) 融化法 ? 將細胞放在低溫下冷凍（約 15℃ ），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。 ?一方面能使細
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