細(xì)胞工程基本技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2024-10-08 20:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 他注意事項(xiàng) 七、無菌操作技術(shù) （無菌操作的基本要領(lǐng)和要求） ? 在細(xì)胞培養(yǎng)中防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的無菌，防止污染。為達(dá)到這一要求，所有工作要進(jìn)行得有條不紊和安全可靠。 （ 一 ） 培養(yǎng)前的準(zhǔn)備 要充分做好培養(yǎng)前的實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備工作 ， 根據(jù)研究內(nèi)容的要求進(jìn)行物品清點(diǎn)包裝 ， 注明標(biāo)簽后滅菌 、 烤干備用 。 在工作前移入超凈工作臺內(nèi) 。 （ 二 ） 培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒 工作面先用新潔爾滅擦拭一遍后，打開紫外線燈滅菌，用 30W紫外線燈管直接照射 20— 30分鐘。然后關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)。 超凈工作臺要用 75％酒精擦拭。 培養(yǎng)用液和培養(yǎng)細(xì)胞不能放在紫外線下直接照射，在操作時(shí)隨手?jǐn)y入。 （ 三 ） 洗手和著裝 原則上與外科手術(shù)洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂 ， 再用流水沖洗 ， 然后用 ％ 新潔爾滅或 75％灑精棉球擦洗 。 穿無菌服 ， 戴無菌帽和口罩 。 （ 四 ） 無菌培養(yǎng)操作 在無菌條件下操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈，此后一切操作，如安裝吸管橡皮頭、打開瓶塞、使用吸管等都要經(jīng)過火焰燒灼，或在近火焰處進(jìn)行（ 火焰消毒） 。 注意金屬器械不能在火焰上燒灼時(shí)間過長，以防退火。燒過的用具要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。 ? 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。 ? 不能用手觸及器皿的無菌部分，如已接觸，要更換或用火焰燒灼觸及部。 為拿取方便 ， 工作臺面上的布局要合理 ， 原則上為右手使用方便的用品放在右側(cè) ， 左手用品在左側(cè) 。 培養(yǎng)液等不要過早開瓶，不要長時(shí)間直立暴露開口，以免增加污染機(jī)會。 吸取不同用液時(shí)，均應(yīng)分別使用不同的吸管，以防擴(kuò)大污染或增加混淆不同細(xì)胞的機(jī)會。 八、顯微技術(shù) ? 各種顯微鏡技術(shù) ? 同細(xì)胞生物學(xué)要掌握原理與應(yīng)用 九、細(xì)胞觀察與分析 ? 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，要及時(shí)觀察和了解生長增殖狀況，包括新生、增殖、消亡等各種狀態(tài)的時(shí)間參數(shù)、細(xì)胞數(shù)量、分布位置等指標(biāo)，以及體外因素對這些指標(biāo)的調(diào)節(jié)機(jī)制。這屬于細(xì)胞動力學(xué)的研究。廣義的細(xì)胞動力學(xué)還包括其它的細(xì)胞運(yùn)動及其原理的研究。 （一）細(xì)胞技術(shù)與活力分析 ? 細(xì)胞計(jì)數(shù)法 ? 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，然后根據(jù)需要進(jìn)行必要的調(diào)整。 ? ? 細(xì)胞生長曲線 ? 生長曲線是反映培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間與培養(yǎng)細(xì)胞濃度之間關(guān)系的曲線。以時(shí)間（橫坐標(biāo)）對細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù) /ml為縱坐標(biāo)）繪制，反映培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長與死亡的動態(tài)變化。 有絲分裂指數(shù)的測定 在一群細(xì)胞中 ， 進(jìn)入分裂期細(xì)胞所占該群細(xì)胞的百分率 ， 即為有絲分裂指數(shù) 。 它反映了細(xì)胞增殖的速度 。 分裂細(xì)胞數(shù) 分裂指數(shù) = 100% 細(xì)胞總數(shù) 細(xì)胞貼壁率 又 稱接種存活率 ， 貼壁附著生長的細(xì)胞狀況直接反映細(xì)胞的生存能力 。 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞周期各時(shí)相控制并按一定的時(shí)間順序予以表達(dá)的 ， 而細(xì)胞周期各時(shí)相的分析 ， 特別是細(xì)胞周期及其各時(shí)相時(shí)長的測定對于研究細(xì)胞群體的生長行為 ， 尤其是對于包括 DNA復(fù)制 、 細(xì)胞分裂在內(nèi)的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)控制的研究 ， 無疑是一個(gè)很重要的前提 。 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計(jì)數(shù) ? 種植 60 mm 培養(yǎng)皿（ 70 X104 個(gè)細(xì)胞 /皿） ? 藥物處理細(xì)胞 ? 收細(xì)胞（胰蛋白酶消化 培養(yǎng)基終止） ? 2022轉(zhuǎn) /分 離心 10min ? 去上清液 PBS重懸，重復(fù) 6的步驟 ? 去上清加入 100 ul 1mg/mlPI 和 100ul 1mg/ml RNase A, 避光處理 30min ? 流式細(xì)胞儀檢測 MTT比色法測定細(xì)胞活力 活細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體脫氫酶活性，可將染料MTT還原為難溶的紫色結(jié)晶物沉積在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)酸性異丙醇溶解后呈現(xiàn)的色度可反映出生活細(xì)胞的代謝水平。而死細(xì)胞則無此酶活性。 ? MTT檢測細(xì)胞存活率 ? 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計(jì)數(shù) ? 種植 96孔板（ 1~10X 103 個(gè)細(xì)胞 /孔） ? 藥物處理細(xì)胞，結(jié)束 4小時(shí)前每孔加入 20 ul 5 mg/ ml MTT ? 棄上清，每孔加 100 ul DMSO ? 560 nm 檢測 ? Viability (%) = OD560, TV/OD560, control 100 ATV( ?? )0 5 10 15 20% of control02040608010012024 h48 h72 h? 成集落實(shí)驗(yàn)（ Colongforming test） ?
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