【文章內(nèi)容簡介】 ? 生殖細胞發(fā)育途徑 : 營養(yǎng)核退化，生殖核發(fā)育 ? 營養(yǎng)細胞和生殖細胞同時發(fā)育的途徑 : ? 花粉均等分裂途徑 : 花藥及 花粉培養(yǎng) 形成胚狀體或愈傷組織 ④ 花粉及小孢子培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)的基本程序是： 取材時期的確定 －外植體 (花蕾 )預(yù)處理 — 外植體消毒 — 花粉或小孢子的分離 — 接種 — 培養(yǎng) ? 取材時期的確定 四分體 — 單核早期 — 單核晚期 — 雙核早期 — 雙核晚期 — 三核期 預(yù)處理有利于改變正常的發(fā)育途徑，而且還可以促進花粉植株的形成 ? 花粉或小孢子的分離 : 花藥 → 小燒杯 (有基本培養(yǎng)基 )→ 擠壓花藥 (注射器內(nèi)管 ) 花粉釋放 → 過濾 (尼龍篩 )→ 低速離心（ 100160r/min)→ 吸管吸掉碎片→ 加入新鮮培養(yǎng)基 → 連續(xù)進行兩次過濾，到每毫升含 103104個花粉 /mL ? 培養(yǎng)方法 花藥看護培養(yǎng) 花粉懸浮培養(yǎng)（微室培養(yǎng)） 花藥及 花粉培養(yǎng) ⑤ 單倍體植株的鑒定與二倍化 ?鑒定方法：形態(tài)學(xué)鑒定 染色體分析 ?單倍體植株的二倍化：繼代加倍 創(chuàng)傷法加倍 秋水仙素處理加倍 花藥及 花粉培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng)包括 胚培養(yǎng) 、 胚珠培養(yǎng)、 子房培養(yǎng) 、 胚乳培養(yǎng)。 ①植物胚培養(yǎng) (embryo culture of plants) ? 克服雜交育種中雜種胚的 ? 早期夭折 ? 胚培養(yǎng)包括成熟胚 (mature embryo)培養(yǎng)； 幼胚 (immature embryo)培養(yǎng) ? 幼胚培養(yǎng)中，常見的生長方式有三種： ? (1)、胚性發(fā)育 (embryonal development) 幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然 按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式 發(fā)育，最后形成成熟胚 (有時甚至可能類似種子 )，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株，這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個幼胚將來就是一個植株。 ? (2)、早熟萌發(fā) (early mature sprouting) 幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長，而是在培養(yǎng)基上 迅速萌發(fā)成幼苗 ，通常稱之為早熟萌發(fā)。在大多數(shù)情況下，一個幼胚萌發(fā)成一個植株，但有時會由于細胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。 ? (3)、愈傷組織 (callus) 在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細胞增殖，形成 愈傷組織 。一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株 。 植物胚胎培養(yǎng) ? ② 子房培養(yǎng) ? 子房培養(yǎng)包括授粉前和授粉后的子房培養(yǎng)。 ? 材料的選擇 品種間的差異 胚囊發(fā)育時期與花粉發(fā)育時期的相關(guān)性（大麥） 花粉發(fā)育時期 胚囊發(fā)育時期 單核中期 大孢子四分體 單核靠邊期 單核至四核胚囊 二核花粉期 八核胚囊 三核花粉期 成熟胚囊 植物胚胎培養(yǎng) ?胚胎培養(yǎng)中單倍體的來源和發(fā)育途徑 由助細胞或胚囊的無配子生殖產(chǎn)生單倍體 卵細胞、助細胞、反助細胞均可發(fā)育產(chǎn)生單倍體 非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體 植物胚胎培養(yǎng) ? ③ 胚乳培養(yǎng) ? 胚乳細胞的全能性？被子植物與裸子植物胚乳（三倍體或單倍體？） （在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細胞是否與其它體細胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。） ? 大多數(shù)被子植物的胚乳是三倍體，能否通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無籽結(jié)實；通過胚乳培養(yǎng)技術(shù)，探索改良農(nóng)、林及園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。 到目前為止，已有 40多種植物的胚乳進行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、葉等或得到愈傷組織。 植物胚胎培養(yǎng) ? 裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它是單倍體組織。 ? 在被子植物中胚乳是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。 植物胚胎培養(yǎng) 細胞懸浮培養(yǎng) 固定化細胞培養(yǎng) 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質(zhì)生產(chǎn) 植物細胞培養(yǎng) (suspension culture) 2 植物細胞工程 ? 細胞懸浮培養(yǎng) 細胞懸浮培養(yǎng)是指將 單個游離細胞 或 小細胞團 在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。植物細胞培養(yǎng)中常用方法。 怎樣獲得 單個游離細胞 ?（酶解）怎樣獲得 小細胞團 ？（愈傷組織分割；機械法；單細胞聚集） 基本過程：外植體（幼胚、胚軸、子葉等）→ 培養(yǎng)基 → 愈傷組織（松散性好、增殖快、再生能力強） 或酶解物 → 震蕩培養(yǎng) → 大量植物細胞 → 次生代謝產(chǎn)物 植物細胞培養(yǎng)(suspension culture) 懸浮培養(yǎng)三個優(yōu)點： ?改善營養(yǎng)供應(yīng)：增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面； ?避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒害； ?可以適當(dāng)改善氣體的交換。 細胞懸 浮培養(yǎng) 一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件： ? 懸浮培養(yǎng)物分散性良好：細胞團較小，一般在30～ 50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。 ? 均一性好：細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 ? 細胞生長迅速：懸浮細胞的生長量一般 2～ 3天甚至更短時間便可增加一倍。 細胞懸 浮培養(yǎng) ： ? 封閉式培養(yǎng)系統(tǒng) 組成、操作、有缺點（ → 半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)） 實例（銀杏、冬青、薔薇等） 細胞懸 浮培養(yǎng) ? 機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng) 機械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進設(shè)計的，根據(jù)植物細胞的特性，其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因為植物細胞生長周期長，需要隨時補充水分和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計加液裝置；由于植物細胞的生理活動需要新鮮空氣，且細胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計通氣裝置； 為便于取樣觀察，一般還設(shè)計有取樣口。 優(yōu)點：很高的 溶氧系數(shù)，適于耐剪切力強的植物細胞培養(yǎng)。 缺點：剪切力大 實例：煙草細胞、水母雪蓮細胞等 ?氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng) 考慮到機械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時攪拌器轉(zhuǎn)動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點是攪拌不均勻。 細胞懸 浮培養(yǎng) 植物懸浮培養(yǎng)（小細胞團）的目的（或應(yīng)用）： ? 種質(zhì)保存 — 固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng) ? 得到大量植物細胞產(chǎn)物 —— 基上進行，如人參干細胞粉；紫草細胞消炎藥物 ? 得到次生代謝產(chǎn)物 —— 液體培養(yǎng) (主要應(yīng)用 ) ? 生物轉(zhuǎn)化 —— 利用酶系的作用將第五轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物 細胞懸 浮培養(yǎng) ? 固定化細胞培養(yǎng) ? ： 指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。 優(yōu)點：穩(wěn)定性好，產(chǎn)物易分離，利于連續(xù)化生產(chǎn) 缺點：只適合分泌到細胞外的次生代謝物的生產(chǎn) 細胞生長分裂旺盛時，次生代謝物產(chǎn)量低。采用固相培養(yǎng)，將細胞培養(yǎng)在惰性基質(zhì)中，細胞生長緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量 . 植物細胞培養(yǎng)(suspension culture) ? 植物細胞固定化的方法 ? ①吸附法 :利用各種固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法。 ? 吸附材料：多孔陶瓷、多孔塑料、多孔玻璃等。 ? 實例：多孔泡沫放入辣椒細胞的培養(yǎng)液中； 固定化細胞培養(yǎng) ? ② 包埋法 ? 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 植物細胞固定化的方法 固定化植物細胞的特點（與植物細胞懸浮培養(yǎng)對比） ①減輕剪切力和其它外界因素對植物細胞的影響，提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定性 （載體的保護作用） ②細胞不易聚集成團（細胞被束縛在一定的范圍） ③更換培養(yǎng)液容易 ④縮短生產(chǎn)周期（可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進行連續(xù)生產(chǎn)）。 ⑤固定化細胞易與培養(yǎng)液分離 ⑥細胞生長緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。 固定化細胞培養(yǎng) 消除代謝產(chǎn)物積累對細胞生長的抑制作用 ? (培養(yǎng)周期 —— 延遲期（ 細胞很少分裂或剛剛開始分裂） ，直線生長期（對數(shù)生長期，細胞生長分裂旺盛時，次生代謝物產(chǎn)量低， 細胞數(shù)目迅速增長，生長速率保持不變生長期，細胞數(shù)增長最快，而細胞的干重和蛋白質(zhì)含量增長較慢 ）， 減緩期（ 細胞數(shù)目的增長速度減緩） ， 靜止期（ 細胞分裂停止，細胞數(shù)目恒定。培養(yǎng)基中營養(yǎng)耗盡，必須進行繼代培養(yǎng)，進入靜止期之前，細胞數(shù)增長減慢，而細胞鮮重和干重增長超過了細胞數(shù)的增長，并一直持續(xù)到靜止期 ） 固定化細胞培養(yǎng) 固定化植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng) ?平床培養(yǎng)系統(tǒng) ?立體培養(yǎng)系統(tǒng) 固定化細胞培養(yǎng) ? 固定化植物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用 固定化細胞培養(yǎng) ? 掃描圖： P115（細胞培養(yǎng)書） 固定化細胞培養(yǎng) 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質(zhì)生產(chǎn) ? 利用培養(yǎng)細胞生產(chǎn)有用物質(zhì)（次生代謝物質(zhì)）的原理 細胞的全能性：培養(yǎng)細胞具有該物種的藥物生物合成（次生代謝物質(zhì)）的全能性。每個植物活細胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。 。 ? 植物次生代謝產(chǎn)物 是指植物中一大類非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為 次生代謝 。 一般程序 ①選材 ? 培養(yǎng)器官、組織的選擇：取有藥效成分的部位，且該部位較