實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-26 00:22 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 蘇組織切成 1cm3小塊，方法根據(jù)樣本而異。 細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，立即放入有機(jī)械分散法、剪切分離法、消化分離法 37℃ 水浴箱中充分溶解，立即（胰酶消化分離法、膠原酶法 ） 離心 500～ 1000r/min1～ 2min，棄掉上清液。獲得細(xì)胞懸液種入 接種入瓶中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 37℃ 培養(yǎng)箱（或 5%CO2培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)24小時(shí)后換液去處對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒物質(zhì)，如 DMSO、 細(xì)胞組織殘?jiān)?、?xì)胞代謝產(chǎn)物 貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞直接去掉上清液 離心去掉上清液，必要時(shí)做細(xì)胞飼養(yǎng)層以凈化細(xì)胞 傳代 細(xì)胞生長(zhǎng) 80％ 以上覆蓋培養(yǎng)瓶底，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同而異， 2－ 3天或 1周左右一代 貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 .消化法，用胰酶－ EDTANa2消化， 直接吹打或離心法、自然沉淀法， 時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定 吸一半液到另一瓶 凍存凍存程序 ★ 細(xì)胞凍存管寫好標(biāo)簽：細(xì)胞名稱，時(shí)間及保存人。 ★ 取 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的細(xì)胞（ 2～ 5 1O 5cells／ ml）， 收集細(xì)胞前 24h換液； ★ 吸出培養(yǎng)液，用 PBS洗細(xì)胞一次，除去，加入消化液 胰蛋白酶 － EDTANa2（ 消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定），去掉消化液，加入培養(yǎng)液充分混勻， 1000rp離心 1min ,去掉上清液； ★ 重懸浮于凍存液中，大約 1～ 5 10 6cells／ ml； ★ 每個(gè)凍存管中加入 lml細(xì)胞懸浮液，擰緊蓋子。 ★ 冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒 30min ～ 1h后 ,再放入 200C冰箱中 2h左右 ， 然后轉(zhuǎn)至 800C冰箱，可保存數(shù)月，如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)在 800C冰箱中放 3h ～ 8h后轉(zhuǎn)至液氮中。 細(xì)胞計(jì)數(shù) 一、原理 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù) /毫升表示。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做 細(xì)胞活力 ，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。 用臺(tái) 盼（酚） 蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。二、儀器、用品與試劑儀器與用品： 普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、 EP管、毛細(xì)吸管等。 試劑 ： SP20細(xì)胞、 ％臺(tái)盼（酚）蘭其配方是：臺(tái)盼（酚）蘭 100ml等。 材料： 細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液的制備： 用毛吸管吸 5滴細(xì)胞懸液到 EP管中，加入1滴 ％臺(tái)盼藍(lán)染液或苯胺黑，混勻，靜置 2～ 3min,活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。三、 操作步驟 將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 靜置 3分鐘。 鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)） /ml＝ （ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù) /4) 稀釋倍數(shù) 104 /ml 四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 104個(gè) /ml， 如果細(xì)胞數(shù)目
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