【文章內(nèi)容簡介】 分散的細(xì)胞）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 ? 器官培養(yǎng) ：是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 52 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化 二、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化 差異： 細(xì)胞離體后，失去了 神經(jīng)體液的調(diào)節(jié) 和 細(xì)胞間的相互影響 ，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化： ?分化現(xiàn)象減弱； ?形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡； ?發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。 因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。 53 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 分化： 體外培養(yǎng)的細(xì)胞 分化能力 并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化 ,關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，如 Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時(shí)能長成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為。 54 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 三、細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 準(zhǔn)備工作： 準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，準(zhǔn)備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。內(nèi)容包括 器皿的清洗、干燥與消毒、培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌、無菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒、培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試 。 55 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 取材： 在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。 56 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上 幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。 取材后應(yīng) 立即處理，盡快培養(yǎng) ，因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置 4℃ 的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格 保持無菌 ，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。 57 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 培養(yǎng)： 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。 58 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括 細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的 PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對 培養(yǎng)溫度 和 CO2濃度 也要定時(shí)檢查。 原代培養(yǎng)一般有一段 潛伏期 （數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等），在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。 59 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為 “ 一代 ” 。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（ Immortality）而無惡性。 60 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 ? 細(xì)胞系（ Cell Line）： 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系（ Lineage of Cells）所組成。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為 有限細(xì)胞系（ Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱 連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（ Infinite Cell Line）。 ? 細(xì)胞株（ Cell Strain）： 通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得 具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物 的稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。 61 62 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程： 游離期 貼壁期 潛伏期 對數(shù)生長期 停止期（平臺(tái)期） 63 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 凍存及復(fù)蘇 : 為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存，這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹 深低溫保存法 (70℃ ~196℃ )的特點(diǎn)。 64 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 細(xì)胞深低溫保存的基本原理： 在 70℃ 以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過 0~20℃ 階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷 。 65 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 細(xì)胞深低溫保存的基本方法： 將細(xì)胞收集至凍存管中加入含 保護(hù)劑 （一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入 37℃ 水中，使之在 一分鐘內(nèi) 迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。 66 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 懸浮細(xì)胞的保存 : 計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約 200～400g離心 5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞； 以 1 107到 5 107細(xì)胞 /ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基（ DMSO終濃度為 510%）中再次懸浮細(xì)胞，或者以 107到 1 107在無血清冷凍培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞； 分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入 4℃ 冰箱中， 5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟； 67 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 ? 傳統(tǒng)方法： ? 程序降溫：可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到 70℃ 到 90℃ 的冰箱中，細(xì)胞以 1℃ /分鐘進(jìn)行冷凍，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。 凍存管置于 4 ℃ 10分鐘 20 ℃ 30分鐘 80 ℃ 1618小時(shí) 液氮 罐長期儲(chǔ)存 68 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 貼壁細(xì)胞的保存 : 使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對細(xì)胞的損傷減少到最?。? 在完全生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)； 以大約 200g離心 5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞； 以 5 106到 1 106細(xì)胞 /ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞； 分裝進(jìn)凍存管，按前述步驟凍存。 69 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 : 凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入完全生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對凍存劑（ DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入完全生長培養(yǎng)基中。 70 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 直接鋪板法 : 取出貯存細(xì)胞， 37℃ 水浴 中 快速融化 ； 直接用完全生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。 1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml完全生長培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在 3 105活細(xì)胞 /ml； 培養(yǎng)細(xì)胞 12~24小時(shí)，更換新鮮的完全生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。 71 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 離心法 : 取出貯存細(xì)胞， 37℃ 水浴中快速融化； 把 12ml凍存細(xì)胞加入到大約 25ml完全生長培養(yǎng)基，輕輕混勻； 以大約 1000rpm離心 23分鐘，棄去上清 ； 在完全生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)； 細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為 3 105活細(xì)胞 /ml。 72 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 凍存過程中 保護(hù)劑的選用 、 細(xì)胞密度 、 降溫速度 及 復(fù)蘇時(shí)溫度 、 融化速度 等都對細(xì)胞活力有影響。 73 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程 常用儀器設(shè)備 : 無菌室 培養(yǎng)器具 無菌過濾器 超凈工作臺(tái) CO2培養(yǎng)箱 洗刷裝置 三重純水蒸餾器 恒溫水浴鍋 細(xì)胞計(jì)數(shù)板 抽氣泵 倒置顯微鏡 電子細(xì)胞技術(shù)儀 壓力蒸氣消毒器 離心機(jī) 電熱恒溫培養(yǎng)箱 74 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 四 細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境 無菌室 無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（ 1