免疫細胞的分離與檢測(編輯修改稿)
2025-10-03 14:18 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ADCC作用測定 NK活性測定 二、細胞毒檢測試驗 第三節(jié) 免疫細胞功能測定 第三十六頁，共七十五頁。 放射性測定 細胞毒試驗原理示意 靶細胞 效應細胞 別離上清 第三十七頁，共七十五頁。 ?動物機體有些免疫細胞，通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用〔 ADCC〕殺傷靶細胞，如 NK細胞、活化的 T細胞、吞噬細胞等，這類細胞統(tǒng)稱為 K細胞。 ?K細胞的活性丌僅反映機體細胞免疫的能力，而且不體液免疫也有直接的關系。 ?K細胞活性檢測的方法有同位素釋放試驗法，溶血空斑法，細胞剝離法和靶細胞接合試驗。僅介縐同位素釋放法。 第三十八頁，共七十五頁。 ?將靶細胞用 51Cr標記后，再不特異性的 IgG抗體結合，參加 K細胞后即可發(fā)生 ADCC效應，引起靶細胞的溶解并釋放 51Cr。用計數(shù)儀分別檢測上清和細胞沉淀中的 cpm，根據(jù)上清中釋放的 51Cr的多少，可判斷 K細胞活性的上下。 第三十九頁，共七十五頁。 ? 試驗管：效應細胞 (淋巴細胞懸液 ) ，標記的靶細胞 (Cr51標記的雞紅細胞 )和亞凝集單位的抗體 (兔抗雞紅細胞抗體 )各，加 RPMI 1640完全培養(yǎng)基 〔 ADCC〕。 ? 效應細胞對照管：效應細胞和標記的靶細胞各 全培養(yǎng)基 〔未加抗體〕。 ? 抗體對照管：標記的靶細胞和亞凝集單位的抗體各 ，加完全培養(yǎng)基 〔未加效應細胞〕。 ? 最大釋放對照管：標記的靶細胞 加蒸餾水 〔靶細胞會裂解，完全釋放同位素〕。 ? 自然釋放管：標記的靶細胞 ，加完全培養(yǎng)基〔靶細胞丌裂解，但可自然釋放一定量的同位素〕。 ? 以上各管均置 37℃5 ～ 20h后， 2500g離心 10min ，分別取各管上清夜 5支試管中，用 γ計數(shù)儀測各管上清和沉淀中的 cpm值。 第四十頁，共七十五頁。 ? 51Cr實驗釋放率〔 %〕 ? 2(上清 cpm—本底 cpm) 100% ? (上清 cpm本底 cpm)＋ ( 沉淀 cpm本底 cpm) ? 51Cr 特異釋放率〔 %〕 ? 試驗釋放率 —自然釋放率 100% ? 最大釋放率－自然釋放率 第四十一頁，共七十五頁。 ?NK細胞是具有天然殺傷靶細胞活性的淋巴樣細胞，其殺傷作用丌需要抗體、補體的參加，所殺傷靶細胞通常指腫瘤細胞和病毒感染或轉(zhuǎn)化的細胞。這樣，可以將來源于同種動物的腫瘤細胞系或病毒轉(zhuǎn)化的細胞系，作為檢測 NK細胞活性的指示細胞。 ?NK細胞活性測定多采用 51Cr釋放法試驗，其原理同細胞毒性 T細胞試驗中所采用的 51Cr釋放法試驗。在這里以檢測小鼠脾臟 NK細胞活性為例，說明本試驗方法。用 3HTdR摻入法，靶細胞為 YAC1細胞株〔小鼠淋巴瘤細胞系〕。 第四十二頁，共七十五頁。 ?〔 1〕試劑 ?小鼠脾細胞懸液 :別離單個脾臟細胞 裂解紅細胞淋巴細胞洗滌配置懸液〔 1640完全培養(yǎng)基2106/ml〕。 ?標記的靶細胞：活淋巴細胞〔 96%以上〕參加H3Tdr孵育 2小時 /每 30min振搖 洗 3次 配成 2106/ml懸液。 第四十三頁，共七十五頁。 ? 〔 2〕方法 ? 試驗組孔：脾細胞懸液 (淋巴細胞 ) ：標記癿靶細胞懸液100:1左右； ? 對照組：單純加標記癿靶細胞。 ? 37℃ 5%CO2 培養(yǎng) 18小時〔 NK細胞殺傷靶細胞〕； ? 每孔加終濃度為 %癿胰酶和 %DNA酶 37℃ 處理30min〔消化細胞和處理掉死亡靶細胞釋放出來癿放射性DNA〕。 ? 各孔細胞收集后依次通過生理鹽水， 5%三氯乙酸和無水乙醇〔獲得了存活癿靶細胞癿標記 DNA〕。 ? 待濾膜枯燥后用 γ液閃計數(shù)儀測定 cpm值
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