【文章內(nèi)容簡介】 －℃水浴中消化20－30分鐘,吸出胰酶溶液,用漢克氏液洗2－3次,再加入適量的營養(yǎng)液(用含5%－10%犢牛血清乳漢液,加適宜抗生素適量)吹打,用4－6層紗布濾過,制成每1 ml含活細胞數(shù)約100－150萬的細胞懸液,分裝于培養(yǎng)瓶中(每10000 ml圓瓶加入細胞 懸液1000 ml)進行培養(yǎng)(每小時轉(zhuǎn)速以9－11為宜).形成單層后備用(地般在24小時內(nèi)應(yīng)用)。 雞胚皮膚細胞單層的制備方法（1） 選擇12－13日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉脫碘，無菌取出雞胚，放入滅菌的玻璃器皿內(nèi)，用漢氏液洗滌胚體，再用滅菌的眼科鑷子將皮膚輕輕地扒下，用剪刀在廣口離心瓶中剪碎并用漢氏液洗2次，%的胰酶溶液（每個雞胚約4ml）~℃水浴中消化20~25分鐘，然后吸出胰酶溶液，加入適當?shù)臓I養(yǎng)液吹打，用4層紗布濾過，制成每1ml含活細胞數(shù)約100萬的懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中（1000ml克氏瓶加入細胞懸液120ml），放入30℃溫箱培養(yǎng)。形成單層后即可進行病毒接種（一般在培養(yǎng)后24h內(nèi)應(yīng)用）。方法（2） 選擇12~13日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉脫碘，無菌取出雞胚，放滅菌的燒杯中，用漢克氏液洗滌胚體，再用滅菌的鑷子將胚夾入另一個放磁棒的滅菌三角瓶中，加37℃%胰酶溶液(每個雞胚8－10ml)，放在磁力攪拌器上以低速攪拌消化約20－25分鐘，取出加入適量含血清的漢克氏液中止消化。然后將胰酶及消化 下來的細胞（即雞胚皮膚細胞）液倒出，底部液用一層紗布濾過。這1000r/min離心10分鐘，去上清液，加入適量培養(yǎng)液吹打分散細胞，用4層紗布濾過。根據(jù)細胞數(shù)加入所需的營養(yǎng)液，制成每1ml含活細胞數(shù)約100萬的細胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中（1000ml克氏瓶加入細胞懸液120ml），培養(yǎng)同上，并用于接毒。 地鼠或乳兔腎細胞單層的制備（用于牛、羊偽狂犬病疫苗）選10－20日齡地鼠或乳兔，放血致死后，無菌采取腎臟，將其皮質(zhì)部組織剪成１－２mm小塊，用漢克氏液洗2－3次后，按組織重量的5倍，%胰酶漢克氏液（－），置36－37℃水浴消化30－40分鐘，除去胰酶溶液后，用細胞生長液制成每1ml含60－80萬細胞的懸液。細胞 置37℃培養(yǎng)，2－4日后形成單層。3 清場和記錄 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等按規(guī)定分別進行處理。 全面填寫《生產(chǎn)工序記錄》。三 病毒的細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是培養(yǎng)病毒最常用的技術(shù)，可用原代細胞、二倍體細胞或傳代細胞系，一般作靜止或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。因病毒與細胞的種類而異，病毒感染細胞可產(chǎn)生自帶病毒，可引起殺細胞變化，也可致非殺細胞變化。殺細胞變化的表現(xiàn)為細胞病變（CPE）涉及細胞膜或細胞骨架的損傷，病毒可使細胞壞死或凋亡。致非殺細胞變化的病毒通常為持續(xù)感染，被感染的細胞可產(chǎn)生干擾素，干擾素反過來干擾其它病毒對細胞的感染，干擾素的抗病毒作用并無病毒特異性（一） 病毒的細胞養(yǎng)特點體外培養(yǎng)動物在100多年前已獲成功，直到20世紀50年代采用了將組織細胞分散的技術(shù)，使組織培養(yǎng)變?yōu)榧毎囵B(yǎng)得以病毒研究，診斷及疫苗制備等方面。組織培養(yǎng)（tissueculture）和細胞培養(yǎng)（cell culture）在此領(lǐng)域基本是同義詞前者包括后者。 1細胞培養(yǎng)中的每個細胞的生理特性基本一致，對病毒的易感性也一致，沒有試驗動物的個體差異，而且可用于試驗的數(shù)量遠遠超過動物和雞胚，并且可在無菌條件下進行標準化試驗，可重復(fù)好2 感染細胞的病變可通過觀察細胞產(chǎn)生的變化如細胞病變等來判定結(jié)果，也可結(jié)合疫學(xué)技術(shù)檢測細胞內(nèi)是否有所培養(yǎng)的病毒。3 細胞培養(yǎng)的重要途徑之一是感染的動物組織內(nèi)分離病毒以及病毒克隆，從樣本分離的病毒可能不是單一的毒株，需要克隆以求純化。通過細胞培養(yǎng)挑選產(chǎn)生的空斑（蝕斑）可達到克隆的目的（二）細胞培養(yǎng)的類型 1原代細胞（primary cell）動物組織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散、獲得單個細胞，在生長于培養(yǎng)皿中大多數(shù)組織均可制備原代細胞，但生長的快慢及難易程度不一，雞胚成纖維細胞（CEF）4h左右即可貼壁，24h可長成致密單層，腎和睪丸生長較慢，原代細胞一般對病毒較易感染，尤其是來源于胚胎或幼畜組織的細胞2 二倍體細胞株（diploid cell strain）將長成的原代細胞消化分散成單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其細胞染色體數(shù)與原代細胞一樣，仍為二倍體。此種細胞數(shù)量可擴大，對病毒的易感性則基本無變化，例如培養(yǎng)豬瘟用的犢牛睪丸細胞、豬傳染性胃腸炎用的乳豬腎細胞3 傳代細胞系（establishell cell line）與上述兩類細胞不同，這類細胞在傳代過程中染色體發(fā)生異常變異，在體外可無限制分裂的異倍體癌變細胞 優(yōu)點：傳代及培養(yǎng)方便，可節(jié)約元材料，因此使用廣泛缺點：1有的對分離的野毒不敏感 2實驗室傳代日久，可能污染支原體、霉形體、或隱性感染病毒。本廠傳代細胞有CRFK F81 DK MARC—104 MARC 145 PK15 BHK21 CHO VERO HELA（三）細胞培養(yǎng)的方法 1 靜止培養(yǎng) 將細胞懸液接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中置于恒溫箱內(nèi)或溫室中靜止培養(yǎng)，細胞成長繁殖成單層或克隆。靜止培養(yǎng)是最常用的細胞培養(yǎng)方法，廣泛用于病毒研究和生物制品制造。例如扁瓶 37℃ 細胞培養(yǎng)板 一般需在含5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)。 2旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 將細胞液接入轉(zhuǎn)瓶后放于恒溫箱的轉(zhuǎn)瓶機上，轉(zhuǎn)數(shù)一般為1012轉(zhuǎn)/h 3懸浮培養(yǎng)是通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終處于分散懸浮于細胞培養(yǎng)液內(nèi)的方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細胞，如生產(chǎn)但克隆抗體的雜交瘤細胞。對于正常細胞（貼壁依賴性細胞）某些傳代細胞不適用，這些細胞在懸浮下很快死亡。 4微載體培養(yǎng)微載體一細小的顆粒未細胞在載體，通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)使細胞在載體表面繁殖成單層的一種細胞培養(yǎng)技術(shù)，兼有單層和懸浮細胞培養(yǎng)的優(yōu)點5中空纖維細胞培養(yǎng) 該技術(shù)模擬動物體內(nèi)環(huán)境，使細胞能在中空纖維上形成類似組織的多層細胞生長，細胞周圍猶如密布微血管，可以不斷獲得營養(yǎng)物質(zhì)，同時又可將細胞代謝產(chǎn)物、廢物和分泌物送到培養(yǎng)液中被運走。系統(tǒng)由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)及容器、供養(yǎng)其和蠕動泵組成（四）單細胞的制備 1 原代細胞的制備 原代細胞制備時首先選取適當組織或器官，如雞胚體、犢牛睪丸、乳豬腎等，采用機械分散法如剪碎、擠壓等使之成為小塊（約為1mm3 ）%－%胰酶(－)消化掉細胞間的組織蛋白,消化的時間長短與溫度、組織的來源及大小等有關(guān)，一般37℃ 消化10－30min，４℃消化需要過夜。消化好的組織塊去掉胰酶經(jīng)吹打成分散的細胞，用于培養(yǎng)。　 2 傳代細胞的制備 單層細胞傳代時多采用FDTA（乙二胺四乙酸二鈉）胰酶消化法，%,其作用是消化細胞間的組織蛋