【正文】 病毒在在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖一般在CPE達(dá)80%左右時(shí)收獲，反復(fù)凍融多次使病毒釋放，然后3000r/min離心15－20min除去細(xì)胞碎片，上清病毒液20℃保存。（4）輕微病變。（2）細(xì)胞聚合。利用精氨酸的支原體抑制需求精氨酸的病毒增殖。而日本乙型腦炎病毒在口腔支原體污染的豬腎傳代細(xì)胞上增殖不受影響。3．支原體污染問(wèn)題 支原體污染影響病毒的增殖，可使病毒蝕斑形成單位平均下降10倍。 病毒的接種方法有兩種：異步接毒和同步接毒。（4）接種量與接種方法 病毒接種一般按維持液的1%~10%（V/V）量接入。細(xì)胞感染病毒后由于代謝障礙而使產(chǎn)酸能力下降，且因細(xì)胞在破壞釋放堿性成分，故維持液pH值下降很慢。（2）溫度 病毒細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多數(shù)為37℃，此溫度有利于病毒吸附和侵入細(xì)胞，如脊髓灰質(zhì)炎病毒在1℃時(shí)對(duì)細(xì)胞的吸附率是其在37℃時(shí)的1/10；口蹄疫病毒于37℃可在3－5min內(nèi)使90％的敏感細(xì)胞發(fā)生感染，而在25℃時(shí)需要20min，15℃以下則很少引起感染。所以犢?；虺膳Ｑ鍖?duì)某些病毒增殖的明顯的抑制作用，如水貂傳染性腸炎病毒和雞傳染性法氏囊病病毒等。但非敏感動(dòng)物的細(xì)胞有時(shí)也能使病毒生長(zhǎng)，如鴨胚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)馬立克氏病毒。目前惟一的方法是將犢牛血清37℃培養(yǎng)１個(gè)月以上，然后高速離心取沉淀物鏡檢檢查膠原蟲(chóng)。有些病毒雖不出現(xiàn)病變，卻干擾目的病毒的增殖。如約胚成纖維細(xì)胞常有禽呼腸孤病毒；在某些細(xì)胞株和細(xì)胞系內(nèi)也有潛在的病毒污染，如PK15細(xì)胞常有豬圓環(huán)病毒污染。日前多用以下方法：（1）抗生素（四環(huán)素、金屬素、卡那霉素、泰樂(lè)霉素、新生霉素）處理；（2）41℃處理18h；（3）加入特異性抗支原體高免血清等。目前細(xì)胞支原體污染率為50％－60％，主要源于犢牛血清、實(shí)驗(yàn)人員、細(xì)胞原始材料及已污染細(xì)胞。在培養(yǎng)液中可見(jiàn)白色或黃色小點(diǎn)狀懸浮物，鏡檢時(shí)可見(jiàn)菌絲結(jié)構(gòu)。１．細(xì)菌污染　　多見(jiàn)于消毒不徹底、操作不嚴(yán)格和環(huán)境污染所致，表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)液很快混濁和PＨ下降，隨著細(xì)胞死亡脫落。低溫對(duì)細(xì)胞影響小，在20~25℃時(shí)對(duì)細(xì)胞仍可緩慢生長(zhǎng)。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和血清。３ 細(xì)胞接種量　　　在適宜的培養(yǎng)條件下，需要有一定量活細(xì)胞才能生長(zhǎng)繁殖，這是因?yàn)榧?xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，這些物質(zhì)分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，作用也小。 無(wú)血清培養(yǎng)液由基礎(chǔ)培養(yǎng)液和血清替代因子組成。不同種細(xì)胞要求血清量也不同，大部分細(xì)胞生長(zhǎng)液中加入１０％血清已可滿足細(xì)胞生長(zhǎng)要求。不同動(dòng)物種血清的作用差別很大，即使同一種動(dòng)物種的不同個(gè)體間的差異也很顯著。血清中的。Eagle液主要成分為13種必需氨基酸、8種維生素、糖和無(wú)機(jī)鹽等成分RPMI16199乳漢液還含有其它氨基酸。細(xì)胞在液氮中可貯存３－５a。也可采用如下程序：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后離心，將細(xì)胞沉淀用凍存液（10%DMSO，20%犢牛血清，70%MEM）懸浮至200萬(wàn)－500萬(wàn)/ml細(xì)胞數(shù)，分裝于細(xì)胞凍存管后4℃放置1h，然后20℃冰箱放置2h，再放入70℃冰箱4－６h后放入液氮保存。為防止細(xì)胞在凍存過(guò)程中因滲透壓、PH值等變化以及機(jī)械損傷而影響活力，須向培養(yǎng)液中加入親水性強(qiáng)、毒性小、易通過(guò)細(xì)胞膜的DMSO（二甲基亞砜）作為保護(hù)劑，從而使冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)下能使細(xì)胞水分在凍結(jié)前透過(guò)細(xì)胞外，以防止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成的傷害。EDTA %其作用是螯合維持細(xì)胞間結(jié)合的鈣鎂離子和細(xì)胞與細(xì)胞間的鈣鎂離子，使細(xì)胞易脫落和分散。 4微載體培養(yǎng)微載體一細(xì)小的顆粒未細(xì)胞在載體，通過(guò)攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)使細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，兼有單層和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)5中空纖維細(xì)胞培養(yǎng) 該技術(shù)模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞能在中空纖維上形成類(lèi)似組織的多層細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞周?chē)q如密布微血管，可以不斷獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)又可將細(xì)胞代謝產(chǎn)物、廢物和分泌物送到培養(yǎng)液中被運(yùn)走。靜止培養(yǎng)是最常用的細(xì)胞培養(yǎng)方法，廣泛用于病毒研究和生物制品制造。3 細(xì)胞培養(yǎng)的重要途徑之一是感染的動(dòng)物組織內(nèi)分離病毒以及病毒克隆，從樣本分離的病毒可能不是單一的毒株，需要克隆以求純化。殺細(xì)胞變化的表現(xiàn)為細(xì)胞病變（CPE）涉及細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架的損傷，病毒可使細(xì)胞壞死或凋亡。3 清場(chǎng)和記錄 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等按規(guī)定分別進(jìn)行處理。這1000r/min離心10分鐘，去上清液，加入適量培養(yǎng)液吹打分散細(xì)胞，用4層紗布濾過(guò)。 雞胚皮膚細(xì)胞單層的制備方法（1） 選擇12－13日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉脫碘，無(wú)菌取出雞胚，放入滅菌的玻璃器皿內(nèi)，用漢氏液洗滌胚體，再用滅菌的眼科鑷子將皮膚輕輕地扒下，用剪刀在廣口離心瓶中剪碎并用漢氏液洗2次，%的胰酶溶液（每個(gè)雞胚約4ml）~℃水浴中消化20~25分鐘，然后吸出胰酶溶液，加入適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)液吹打，用4層紗布濾過(guò)，制成每1ml含活細(xì)胞數(shù)約100萬(wàn)的懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中（1000ml克氏瓶加入細(xì)胞懸液120ml），放入30℃溫箱培養(yǎng)。 使用前按物品的物流及消毒要求移入潔凈工作間待用。保證生產(chǎn)的順利進(jìn)行。、規(guī)格及用量。、頒發(fā)部門(mén)、生效日期。7 軋蓋、貼簽 操作內(nèi)容見(jiàn)《軋蓋、貼簽崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》。 清場(chǎng)和記錄 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理。 在工作開(kāi)始前30～40min，按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要求。 清場(chǎng)和記錄 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理。收毒的次數(shù)依細(xì)胞生長(zhǎng)狀況而定，一般收毒在六收左右。 在工作開(kāi)始前30～40min，按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要求。 清場(chǎng)和記錄 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場(chǎng)，對(duì)工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進(jìn)行處理。 特異性 將毒種用抗豬瘟病毒特異性血清中和后，接種家兔2只，在96h內(nèi)不引起熱反應(yīng)及發(fā)病死亡。 病毒含量 脾毒對(duì)家兔的最小感染量為≤105/m1。 細(xì)胞毒的繁殖用細(xì)胞維持液，%～%的病毒懸液，接種生長(zhǎng)良好的牛細(xì)胞，置36～37℃繼續(xù)培養(yǎng)。 稽留期 ℃算起，到體溫下降到常溫或接近常溫的間隔時(shí)間。) 潛伏期不到24h，或超過(guò)72h以上，體溫曲線起伏不定，或稽留不到12h，或稽留超過(guò)36h而不下降。 測(cè)溫觀察 家兔接種后，上、下午各測(cè)體溫一次，24h后，每隔6h測(cè)體溫一次。 操作規(guī)則 毒種繁殖 脾毒的繁殖 家兔的選擇 選用營(yíng)養(yǎng)良好，～。 全面填寫(xiě)《生產(chǎn)工序記錄》。 細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)無(wú)特異性病變，無(wú)細(xì)菌、霉菌（見(jiàn)《無(wú)菌（純粹）檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》）和支原體（見(jiàn)《支原體檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》）污染，不吸附豚鼠紅細(xì)