科研思路和方法作業(yè)(編輯修改稿)
2025-09-01 09:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 MHCⅡ、蛋白的表達(dá)及分布規(guī)律。① 制備樣品：處死動(dòng)物，取股骨骨髓，10%福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋，4μm厚切片。② 免疫組化染色檢測(cè)方法：鼠抗人IFNγ單克隆抗體(DO27)（武漢博士德生物有限責(zé)任公司，濃度1:50）；鼠抗人 cyclinD1單克隆抗體（DCS/6）（NeoMarker福州邁新公司，濃度1:100）；鼠抗人單克隆抗體CⅡTa 、JakJakMHCⅠ、MHCⅡ（晶美公司）；SP免疫組化試劑盒（北京中山公司）。ABC法： mol/L PBST洗，(%H2O2)作用30 min，,10 min3次，與一抗4℃溫育， mol/L PBST洗,10 min3次，與二抗(1:1000稀釋)室溫作用2 h， mol/L PBST洗，10 min3次，與ABC(1:2000稀釋)室溫作用1 ，10 min， mol/L TrisHCl緩沖液終止反應(yīng)，用包被有明膠的玻片固定、水洗，用系列濃度乙醇(70%1次，80%1次，90%2次，95%2次，100%3次，每次5 min)脫水，二甲苯中透明，封邊。③ 分析方法：IFNγ、CⅡTa、Stat1α、JakJakMHCⅠ、MHCⅡ免疫組化陽性信號(hào)均為棕黃色細(xì)顆粒狀，染色結(jié)果按陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度綜合記分作半定量分析。 western blot檢測(cè)：皮損組織IFNγ、CⅡTa、Stat1α、JakJakMHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表達(dá)。①制備樣品：取樣品1106～1107細(xì)胞，PBS清洗，～1ml總蛋白抽提試劑抽提總蛋白；使用KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，測(cè)定樣品濃度。②方法：變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDSPAGE)；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜，30mA恒流，4176。C轉(zhuǎn)移，過夜；膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時(shí)，；加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體，室溫孵育1小時(shí)；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，X膠片曝光顯影。③ 分析方法：掃描圖片，用ImageJ分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化；將目的蛋白灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值，校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。 RTPCR法檢測(cè)：皮損組織CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。① 提取總RNA：取標(biāo)本，用試劑(GIBCO公司，美國(guó))提取總RNA，溶于無RNA酶的滅菌超純水中，用紫外分光分度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度，同時(shí)瓊脂糖電泳觀察其完整性。將RNA稀釋成1mg/L，80176。C保存。② MHCⅠ、M
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