【文章內(nèi)容簡介】 針的5’端報告基團從探針上切除，使之與淬滅基團分離，從而釋放出相對應的熒光，而沒有配對的探針仍然保持完整而不會發(fā)熒光。不同的等位基因探針由于標記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號不同，可通過對熒光信號的檢測判斷樣本的基因型。實時熒光PCR法靈敏度高，分型準確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及，易于推廣使用。但該方法通量不高，探針成本較高，單個位點的檢測成本與樣本量有關(guān)，樣本量越小，成本越高。本方法主要適于對少量位點、大樣本進行分型。目前CFDA已批準CYP2CVKORC1等多種基因多態(tài)性檢測的PCR熒光檢測試劑盒。4）PCR基因芯片法該方法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過PCR擴增、熒光標記等程序，按堿基配對原理與芯片雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片上的熒光信號進行檢測和分析，從而迅速獲得個體的基因型信息?；蛐酒中头ǖ牟僮鬟^程包括PCR核酸擴增、雜交、芯片掃描和結(jié)果分析。該方法用于DNA基因分型時屬于定性檢測，靈敏度為50 ng/μL?；蛐酒ǚ治鰰r需設(shè)置陰性對照和陽性質(zhì)控品。應用基因芯片檢測試劑盒時應確保試劑在開封前按要求保存、各組分液體使用前振蕩混勻，雜交和洗片操作務必在避光條件下進行，PCR反應液和定位參照需避光保存，芯片加樣時注意使液體鋪滿整個反應區(qū)，但不能溢出、不能出現(xiàn)氣泡，以防交叉污染。其主要優(yōu)點是可同時對多個待測SNP位點進行檢測。我國CFDA已批準多種用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因如ALDHCYP2CCY2C1CYP2DADRACE、VKORC1多態(tài)性檢測的基因芯片試劑盒。5）PCR電泳分析該方法是指對待分析的目的基因片段進行PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小對基因多態(tài)性位點進行基因分型。該方法屬于定性檢測，且只能用于對已知的多態(tài)性位點進行檢測，不能識別未知多態(tài)性。瓊脂糖電泳法適用于對片段較長的插入缺失多態(tài)性進行檢測，如ACE插入缺失多態(tài)性；毛細管電泳法適于對較短的插入缺失多態(tài)性如UGT1A1*28多態(tài)性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）進行檢測。PCR過程中需建立陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，電泳分析時需同時用分子量標記物進行片段大小的判斷。當分子量標記物反應管無條帶或出現(xiàn)較弱的條帶時，可能的原因包括點樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時間過長或電壓過大。該方法的優(yōu)點是成本低，在普通實驗室即可開展；缺點是只適合對DNA插入/缺失多態(tài)性或融合基因進行定性測定，不能用于SNP的檢測。6）PCR高分辨率熔解曲線（HRM）法該方法通過對PCR反應的熔解曲線分析進行基因分型。PCR擴增的熔解曲線取決于其擴增序列，序列中一個堿基的差異都可導致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化。HRM法應用實時熒光定量PCR儀監(jiān)測這種細微的溫度變化，確定所擴增的目的片段中是否存在突變，從而用于基因分型。HRM分析使用LC Green等飽和熒光染料，該類染料在飽和濃度時對PCR反應無抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結(jié)合DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝。在雙鏈DNA的變性過程不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提升，因此，熔解曲線細微的變化可以反映擴增片段中堿基的差異。應用本方法進行基因分型屬于定性分析。該方法操作簡便、快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準確，有利于實現(xiàn)閉管操作，在進行甲基化檢測時可根據(jù)熔解曲線確定甲基化程度的高低。該方法的缺點是：不能排除待測核酸中新出現(xiàn)的遺傳變異；由于單個堿基突變導致DNA解鏈溫度的變化非常小，該方法對儀器的靈敏度和分辨率有較高要求。7）等位基因特異性PCR（Allelespecific PCR，ASPCR）又稱為擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMSPCR）。該技術(shù)的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端錯配的堿基會導致引物延伸速度變慢，當錯配達到一定程度時，引物延伸將終止，得不到特異長度的PCR擴增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒有與引物3’端配對的堿基，反之則有。因此，ASPCR反應需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，兩條非特異性引物在3’端與模板錯配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3’端與模板完全配對時，PCR擴增才可以進行。PCR產(chǎn)物可通過凝膠電泳進行分析和基因型的判斷。該方法也可與實時熒光定量PCR結(jié)合起來進行基因分型。該方法可以用于檢測各種類型的SNP，其優(yōu)勢是靈敏度高，特別適合于對腫瘤組織中的體細胞突變進行檢測；缺點是假陽性率較高。8）PCR限制性片段長度多態(tài)性方法限制性片段長度多態(tài)性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的經(jīng)典方法之一，現(xiàn)在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性內(nèi)切酶可以特異性識別某一特定序列和結(jié)構(gòu)DNA，并對其進行剪切的原理。限制性內(nèi)切酶通常識別雙鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產(chǎn)生較短的DNA片段。由于限制性內(nèi)切酶識別序列的嚴格性，一個堿基的變化都可以導致酶切活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點在某一限制性內(nèi)切酶的識別位點上，將會導致該酶只對其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對位于限制性酶切識別位點的SNP進行分型時，可以使用包含該位點的PCR產(chǎn)物與相應的限制性內(nèi)切酶進行溫育。酶切以后的產(chǎn)物進行電泳，并根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小來進行基因分型。該方法不需要任何探針，也不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，實驗過程簡單，可操作性強。但缺點也很明顯，主要是通量太低，大量分型時工作量大，并且只適用于部分SNP分型。9）原位雜交（ISH）法ISH法以各種人體標本，包括相應實驗方法制備的細胞學和組織學標本（福爾馬林固定石蠟包埋）作為靶標，采用目的DNA探針與該靶標進行分子雜交，從而檢測相關(guān)的靶基因異常。ISH技術(shù)按照探針標記物的類型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜交（FISH）。ISH法檢測的靶標具有完整的細胞核，無需進行核酸的提取。其具體的方法學原理見《原位雜交（ISH）指南》。在藥物代謝酶和靶點基因檢測中，ISH法主要用于測定基因擴增和基因缺失異常。表1. 各種藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)優(yōu)缺點及適用性比較方 法優(yōu) 點缺 點適用性ASPCR靈敏度高，適于對腫瘤組織中突變比例較低的體細胞突變進行檢測。通量低對小樣本、低突變比例的體細胞突變進行檢測。實時熒光PCR通量較高，操作簡單，儀器設(shè)備易普及。探針較昂貴對相同位點、大樣本標本進行檢測，可用于mRNA表達檢測。焦磷酸測序高通量，高靈敏度，可以檢測插入/缺失突變和未知突變。等位基因含量的比例可用于室內(nèi)質(zhì)控。需要特殊儀器設(shè)備。適合于較大樣本、突變比例高于5％的各種類型SNP檢測、甲基化位點的確定。HRM成本低，靈敏度高，閉管操作，降低污染風險。需要特殊儀器設(shè)備，條件摸索過程較為困難適合有該類機器的實驗室開展各種類型SNP分型研究；可用于已知甲基化位點的檢測。Sanger法測序直接獲取序列，分型的金標準，可發(fā)現(xiàn)未知突變。通量低，不能檢測突變比例小于20％的SNP。各種SNP的檢測，未知突變的篩查以及驗證其他分型的結(jié)果。PCRRFLP無需特殊的儀器設(shè)備，成本較低，實驗過程簡單，可操作性強。通量低，只適用于部分SNP分型適用于無條件夠買貴重儀器設(shè)備的實驗室開展小樣本的分型檢測。基因芯片法通量高靈活度低，成本高，需要特殊的儀器設(shè)備。適用于具備芯片檢測能力的實驗室對已知固定位點、大樣本標本進行檢測。原位雜交（ISH）在細胞核原位對基因的異常進行檢測成本高，通量低，時間較長。適于對基因擴增和缺失異常進行檢測。 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測項目及類型遺傳藥理學知識庫（PharmGKB）根據(jù)項目成熟程度將個體化用藥基因檢測項目分為4級，并認為其中1級項目（包括1A級和1B級）滿足臨床應用的最高標準，而4級項目適于臨床應用的證據(jù)最少[1]。1A級項目為同時獲臨床遺傳藥理學實施聯(lián)盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation consortium，CPIC）、認可CPIC藥物基因組學指南的醫(yī)學會、以及美國國家衛(wèi)生研究院藥物基因組學研究網(wǎng)絡(luò)（Pharmagenomics Research Network，PGRN）認同的項目，這類項目通常經(jīng)大規(guī)模隨機對照臨床試驗（RCT）對項目的意義進行了論證；1B級項目有確切的臨床證據(jù)提示相關(guān)性，且這種相關(guān)性被具有一定樣本規(guī)模的研究所證實，但還需進一步的臨床證據(jù)。根據(jù)檢測項目所涉及的基因在影響藥物反應中的作用機制和被測靶分子（DNA或RNA）的不同，個體化用藥分子檢測項目包括藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運體基因遺傳多態(tài)性檢測、藥物作用靶點基因遺傳變異檢測、其他基因變異檢測和藥物作用靶點基因mRNA表達檢測四種類型（附錄C）。、維護與保養(yǎng)原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量保證指南》的要求進行。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測涉及的儀器設(shè)備眾多，實驗室可參考生產(chǎn)商提供的操作說明書編寫書面的、有案可查的預防性維護及校準計劃，確定儀器設(shè)備的維護周期，建立儀器設(shè)備日常維護的SOP。對于某些計量分析儀器，應依照我國計量法規(guī)定，由計量檢定機構(gòu)定期進行校驗，并保存好校驗證書。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護包括對溫度進行監(jiān)測。儀器維護過程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統(tǒng)。每臺儀器應該配備專用的清潔工具。在例行儀器的維護和保養(yǎng)后，應填寫儀器維護保養(yǎng)記錄表。如維護中發(fā)現(xiàn)問題，應及時匯報并將出現(xiàn)的問題詳細記錄，最后由維護操作人員簽名。原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量保證指南》的要求進行。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結(jié)果分析和報告等步驟。操作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)知識和經(jīng)驗才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果。加強人員培訓是確保檢測質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓分為入職培訓、內(nèi)部培訓和外部培訓。通過培訓，讓操作人員掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨立進行質(zhì)控活動和儀器維護的能力，可對試劑和質(zhì)控品的出入庫及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進行準確記錄，進行數(shù)據(jù)分析。實驗室工作人員在培訓后書面確認其已接受適當?shù)呐嘤枺喿x并理解了相關(guān)SOP。實驗室應對實驗室工作人員進行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開展內(nèi)部培訓。外部培訓包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學檢測培訓基地等機構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓。原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量保證指南》的要求進行。臨床檢驗實驗室應用的體外診斷試劑包括國家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準的試劑盒和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學檢測試點單位通過性能評定、具有嚴格標準操作規(guī)程（SOP）的自配試劑（LDT）。所有試劑都需進行性能評價。實驗室所購買的商業(yè)化的儀器應根據(jù)說明書進行驗證。在報告結(jié)果之前實驗室應該證明其性能能夠滿足廠家規(guī)定的準確度、精密度、線性與可報告范圍和參考區(qū)間。實驗室還應該為每個檢測系統(tǒng)建立性能規(guī)范，包括適用性、準確度、精密度和分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報告范圍和其他重要特性，并根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準和質(zhì)控程序相關(guān)活動的記錄。同時也需對檢驗中的耗材進行質(zhì)檢。個體化醫(yī)學分子檢測包括定性檢測和定量檢測。定性檢測的性能驗證指標主要包括重復性/精密度、準確度（突變型的檢測能力）、分析特異性、檢出限等，可參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的EPl2一A2文件進行。定量檢測監(jiān)測體系性能驗證的指標主要包括準確度、精密度、線性、可報告范圍、檢出限、參考區(qū)間、靈敏度、特異性等。準確度的評價有兩種方法，一種方法是與標準物質(zhì)進行比較，使用待評估的項目對已知標準的標準物質(zhì)（如定性檢測中用到的陽性參照品）進行分析，將檢測結(jié)果與已知標準值進行比較；第二種方法是同時用待評估項目與標準方法（或參考方法）對同一批次樣品進行分析，然后將不同方法得到的結(jié)果進行對比分析。精密度是指重復檢測條件下，獲得的獨立測量結(jié)果間的一致程度，是對檢測體系隨機誤差的一種度量，常用標準差表示，標準差越小精密度越好。定性檢測的精密度還包括一份陽性或陰性樣本在多次檢測中，是否能得到可重復的陽性或陰性結(jié)果。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因變異檢測體系進行準確度、精密度等性能驗證時所使用的參考物質(zhì)為各種突變型和野生型質(zhì)?；蛲蛔兗毎?。線性分析可直接分析已知濃度的樣品，也可將一定濃度的樣品進行系列稀釋后，根據(jù)稀釋因子來研究檢測值與逐步下降的預期估計濃度之間是否存在線性。可報告范圍是能夠報告的可靠的最低和最高檢測結(jié)果，實驗室可通過“多點法”進行簡單驗證，推薦應用5個不同濃度水平的樣品進行驗證。LoD是指可被檢測體系檢出的最低檢測濃度，又稱最小檢測濃度或檢測底限。建立和驗證LoD時，需同時建立、驗證空白檢測限。檢出限一般由廠家、方法建立者完成，實驗室LDT試劑應確立方法的LoD。臨界值是鑒別樣品、作為判斷特定疾病、狀態(tài)或被測量物存在與否的界限的量值。測量結(jié)果高于臨界值判斷為陽性，低于臨界值判斷為陰性，接近臨界值判斷為非確定性。臨界值的選擇決定檢驗的診斷特異性和診斷靈敏度。目前已有部分臨床治療指南將藥物靶點基因的mRNA表達水平高低（如ERCC1和RRM1）作為指導用藥的依據(jù)，然而目前對待測靶mRNA表達水平臨界值的確定尚未明確。分子診斷實驗室可通過繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）確定診斷閾值，得到合適的敏感度和特異度。ROC曲線趨左上角靠近，曲線下面積就越大，其臨床檢驗的準確性就越好。臨檢過程中應按照試劑盒生產(chǎn)商的說明或定義定期對臨界值進行評審。LDT試劑的性能評估包括樣品的類型與數(shù)量、所選擇的參比方法、評價指標、準確度、重復性與精密度、線性范圍、檢測范圍、分析的靈敏度與特異性、參考區(qū)間或cutoff值及臨床性能評估結(jié)果。具體可參考國家衛(wèi)計委《個體化醫(yī)學檢測LDT研制技術(shù)規(guī)范》。原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量保證指南》的要求進行。分析后質(zhì)量保證包括檢測報告、結(jié)果解釋