【文章內(nèi)容簡介】 針的5’端報告基團(tuán)從探針上切除，使之與淬滅基團(tuán)分離，從而釋放出相對應(yīng)的熒光，而沒有配對的探針仍然保持完整而不會發(fā)熒光。不同的等位基因探針由于標(biāo)記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號不同，可通過對熒光信號的檢測判斷樣本的基因型。實(shí)時熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及，易于推廣使用。但該方法通量不高，探針成本較高，單個位點(diǎn)的檢測成本與樣本量有關(guān)，樣本量越小，成本越高。本方法主要適于對少量位點(diǎn)、大樣本進(jìn)行分型。目前CFDA已批準(zhǔn)CYP2CVKORC1等多種基因多態(tài)性檢測的PCR熒光檢測試劑盒。4）PCR基因芯片法該方法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記等程序，按堿基配對原理與芯片雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片上的熒光信號進(jìn)行檢測和分析，從而迅速獲得個體的基因型信息?；蛐酒中头ǖ牟僮鬟^程包括PCR核酸擴(kuò)增、雜交、芯片掃描和結(jié)果分析。該方法用于DNA基因分型時屬于定性檢測，靈敏度為50 ng/μL?；蛐酒ǚ治鰰r需設(shè)置陰性對照和陽性質(zhì)控品。應(yīng)用基因芯片檢測試劑盒時應(yīng)確保試劑在開封前按要求保存、各組分液體使用前振蕩混勻，雜交和洗片操作務(wù)必在避光條件下進(jìn)行，PCR反應(yīng)液和定位參照需避光保存，芯片加樣時注意使液體鋪滿整個反應(yīng)區(qū)，但不能溢出、不能出現(xiàn)氣泡，以防交叉污染。其主要優(yōu)點(diǎn)是可同時對多個待測SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測。我國CFDA已批準(zhǔn)多種用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因如ALDHCYP2CCY2C1CYP2DADRACE、VKORC1多態(tài)性檢測的基因芯片試劑盒。5）PCR電泳分析該方法是指對待分析的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小對基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。該方法屬于定性檢測，且只能用于對已知的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，不能識別未知多態(tài)性。瓊脂糖電泳法適用于對片段較長的插入缺失多態(tài)性進(jìn)行檢測，如ACE插入缺失多態(tài)性；毛細(xì)管電泳法適于對較短的插入缺失多態(tài)性如UGT1A1*28多態(tài)性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）進(jìn)行檢測。PCR過程中需建立陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，電泳分析時需同時用分子量標(biāo)記物進(jìn)行片段大小的判斷。當(dāng)分子量標(biāo)記物反應(yīng)管無條帶或出現(xiàn)較弱的條帶時，可能的原因包括點(diǎn)樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時間過長或電壓過大。該方法的優(yōu)點(diǎn)是成本低，在普通實(shí)驗(yàn)室即可開展；缺點(diǎn)是只適合對DNA插入/缺失多態(tài)性或融合基因進(jìn)行定性測定，不能用于SNP的檢測。6）PCR高分辨率熔解曲線（HRM）法該方法通過對PCR反應(yīng)的熔解曲線分析進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增的熔解曲線取決于其擴(kuò)增序列，序列中一個堿基的差異都可導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化。HRM法應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR儀監(jiān)測這種細(xì)微的溫度變化，確定所擴(kuò)增的目的片段中是否存在突變，從而用于基因分型。HRM分析使用LC Green等飽和熒光染料，該類染料在飽和濃度時對PCR反應(yīng)無抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結(jié)合DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝。在雙鏈DNA的變性過程不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提升，因此，熔解曲線細(xì)微的變化可以反映擴(kuò)增片段中堿基的差異。應(yīng)用本方法進(jìn)行基因分型屬于定性分析。該方法操作簡便、快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，有利于實(shí)現(xiàn)閉管操作，在進(jìn)行甲基化檢測時可根據(jù)熔解曲線確定甲基化程度的高低。該方法的缺點(diǎn)是：不能排除待測核酸中新出現(xiàn)的遺傳變異；由于單個堿基突變導(dǎo)致DNA解鏈溫度的變化非常小，該方法對儀器的靈敏度和分辨率有較高要求。7）等位基因特異性PCR（Allelespecific PCR，ASPCR）又稱為擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMSPCR）。該技術(shù)的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端錯配的堿基會導(dǎo)致引物延伸速度變慢，當(dāng)錯配達(dá)到一定程度時，引物延伸將終止，得不到特異長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒有與引物3’端配對的堿基，反之則有。因此，ASPCR反應(yīng)需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，兩條非特異性引物在3’端與模板錯配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3’端與模板完全配對時，PCR擴(kuò)增才可以進(jìn)行。PCR產(chǎn)物可通過凝膠電泳進(jìn)行分析和基因型的判斷。該方法也可與實(shí)時熒光定量PCR結(jié)合起來進(jìn)行基因分型。該方法可以用于檢測各種類型的SNP，其優(yōu)勢是靈敏度高，特別適合于對腫瘤組織中的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測；缺點(diǎn)是假陽性率較高。8）PCR限制性片段長度多態(tài)性方法限制性片段長度多態(tài)性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的經(jīng)典方法之一，現(xiàn)在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性內(nèi)切酶可以特異性識別某一特定序列和結(jié)構(gòu)DNA，并對其進(jìn)行剪切的原理。限制性內(nèi)切酶通常識別雙鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產(chǎn)生較短的DNA片段。由于限制性內(nèi)切酶識別序列的嚴(yán)格性，一個堿基的變化都可以導(dǎo)致酶切活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點(diǎn)在某一限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)上，將會導(dǎo)致該酶只對其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對位于限制性酶切識別位點(diǎn)的SNP進(jìn)行分型時，可以使用包含該位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行溫育。酶切以后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小來進(jìn)行基因分型。該方法不需要任何探針，也不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，實(shí)驗(yàn)過程簡單，可操作性強(qiáng)。但缺點(diǎn)也很明顯，主要是通量太低，大量分型時工作量大，并且只適用于部分SNP分型。9）原位雜交（ISH）法ISH法以各種人體標(biāo)本，包括相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法制備的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本（福爾馬林固定石蠟包埋）作為靶標(biāo)，采用目的DNA探針與該靶標(biāo)進(jìn)行分子雜交，從而檢測相關(guān)的靶基因異常。ISH技術(shù)按照探針標(biāo)記物的類型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜交（FISH）。ISH法檢測的靶標(biāo)具有完整的細(xì)胞核，無需進(jìn)行核酸的提取。其具體的方法學(xué)原理見《原位雜交（ISH）指南》。在藥物代謝酶和靶點(diǎn)基因檢測中，ISH法主要用于測定基因擴(kuò)增和基因缺失異常。表1. 各種藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)及適用性比較方 法優(yōu) 點(diǎn)缺 點(diǎn)適用性ASPCR靈敏度高，適于對腫瘤組織中突變比例較低的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測。通量低對小樣本、低突變比例的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測。實(shí)時熒光PCR通量較高，操作簡單，儀器設(shè)備易普及。探針較昂貴對相同位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本進(jìn)行檢測，可用于mRNA表達(dá)檢測。焦磷酸測序高通量，高靈敏度，可以檢測插入/缺失突變和未知突變。等位基因含量的比例可用于室內(nèi)質(zhì)控。需要特殊儀器設(shè)備。適合于較大樣本、突變比例高于5％的各種類型SNP檢測、甲基化位點(diǎn)的確定。HRM成本低，靈敏度高，閉管操作，降低污染風(fēng)險。需要特殊儀器設(shè)備，條件摸索過程較為困難適合有該類機(jī)器的實(shí)驗(yàn)室開展各種類型SNP分型研究；可用于已知甲基化位點(diǎn)的檢測。Sanger法測序直接獲取序列，分型的金標(biāo)準(zhǔn)，可發(fā)現(xiàn)未知突變。通量低，不能檢測突變比例小于20％的SNP。各種SNP的檢測，未知突變的篩查以及驗(yàn)證其他分型的結(jié)果。PCRRFLP無需特殊的儀器設(shè)備，成本較低，實(shí)驗(yàn)過程簡單，可操作性強(qiáng)。通量低，只適用于部分SNP分型適用于無條件夠買貴重儀器設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室開展小樣本的分型檢測?；蛐酒ㄍ扛哽`活度低，成本高，需要特殊的儀器設(shè)備。適用于具備芯片檢測能力的實(shí)驗(yàn)室對已知固定位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本進(jìn)行檢測。原位雜交（ISH）在細(xì)胞核原位對基因的異常進(jìn)行檢測成本高，通量低，時間較長。適于對基因擴(kuò)增和缺失異常進(jìn)行檢測。 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測項(xiàng)目及類型遺傳藥理學(xué)知識庫（PharmGKB）根據(jù)項(xiàng)目成熟程度將個體化用藥基因檢測項(xiàng)目分為4級，并認(rèn)為其中1級項(xiàng)目（包括1A級和1B級）滿足臨床應(yīng)用的最高標(biāo)準(zhǔn)，而4級項(xiàng)目適于臨床應(yīng)用的證據(jù)最少[1]。1A級項(xiàng)目為同時獲臨床遺傳藥理學(xué)實(shí)施聯(lián)盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation consortium，CPIC）、認(rèn)可CPIC藥物基因組學(xué)指南的醫(yī)學(xué)會、以及美國國家衛(wèi)生研究院藥物基因組學(xué)研究網(wǎng)絡(luò)（Pharmagenomics Research Network，PGRN）認(rèn)同的項(xiàng)目，這類項(xiàng)目通常經(jīng)大規(guī)模隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)（RCT）對項(xiàng)目的意義進(jìn)行了論證；1B級項(xiàng)目有確切的臨床證據(jù)提示相關(guān)性，且這種相關(guān)性被具有一定樣本規(guī)模的研究所證實(shí)，但還需進(jìn)一步的臨床證據(jù)。根據(jù)檢測項(xiàng)目所涉及的基因在影響藥物反應(yīng)中的作用機(jī)制和被測靶分子（DNA或RNA）的不同，個體化用藥分子檢測項(xiàng)目包括藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體基因遺傳多態(tài)性檢測、藥物作用靶點(diǎn)基因遺傳變異檢測、其他基因變異檢測和藥物作用靶點(diǎn)基因mRNA表達(dá)檢測四種類型（附錄C）。、維護(hù)與保養(yǎng)原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測涉及的儀器設(shè)備眾多，實(shí)驗(yàn)室可參考生產(chǎn)商提供的操作說明書編寫書面的、有案可查的預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)計劃，確定儀器設(shè)備的維護(hù)周期，建立儀器設(shè)備日常維護(hù)的SOP。對于某些計量分析儀器，應(yīng)依照我國計量法規(guī)定，由計量檢定機(jī)構(gòu)定期進(jìn)行校驗(yàn)，并保存好校驗(yàn)證書。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護(hù)包括對溫度進(jìn)行監(jiān)測。儀器維護(hù)過程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統(tǒng)。每臺儀器應(yīng)該配備專用的清潔工具。在例行儀器的維護(hù)和保養(yǎng)后，應(yīng)填寫儀器維護(hù)保養(yǎng)記錄表。如維護(hù)中發(fā)現(xiàn)問題，應(yīng)及時匯報并將出現(xiàn)的問題詳細(xì)記錄，最后由維護(hù)操作人員簽名。原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結(jié)果分析和報告等步驟。操作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)知識和經(jīng)驗(yàn)才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果。加強(qiáng)人員培訓(xùn)是確保檢測質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓(xùn)分為入職培訓(xùn)、內(nèi)部培訓(xùn)和外部培訓(xùn)。通過培訓(xùn)，讓操作人員掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨(dú)立進(jìn)行質(zhì)控活動和儀器維護(hù)的能力，可對試劑和質(zhì)控品的出入庫及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進(jìn)行準(zhǔn)確記錄，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)室工作人員在培訓(xùn)后書面確認(rèn)其已接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，閱讀并理解了相關(guān)SOP。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開展內(nèi)部培訓(xùn)。外部培訓(xùn)包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗(yàn)中心和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的體外診斷試劑包括國家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的試劑盒和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測試點(diǎn)單位通過性能評定、具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的自配試劑（LDT）。所有試劑都需進(jìn)行性能評價。實(shí)驗(yàn)室所購買的商業(yè)化的儀器應(yīng)根據(jù)說明書進(jìn)行驗(yàn)證。在報告結(jié)果之前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該證明其性能能夠滿足廠家規(guī)定的準(zhǔn)確度、精密度、線性與可報告范圍和參考區(qū)間。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)該為每個檢測系統(tǒng)建立性能規(guī)范，包括適用性、準(zhǔn)確度、精密度和分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報告范圍和其他重要特性，并根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準(zhǔn)和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準(zhǔn)和質(zhì)控程序相關(guān)活動的記錄。同時也需對檢驗(yàn)中的耗材進(jìn)行質(zhì)檢。個體化醫(yī)學(xué)分子檢測包括定性檢測和定量檢測。定性檢測的性能驗(yàn)證指標(biāo)主要包括重復(fù)性/精密度、準(zhǔn)確度（突變型的檢測能力）、分析特異性、檢出限等，可參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的EPl2一A2文件進(jìn)行。定量檢測監(jiān)測體系性能驗(yàn)證的指標(biāo)主要包括準(zhǔn)確度、精密度、線性、可報告范圍、檢出限、參考區(qū)間、靈敏度、特異性等。準(zhǔn)確度的評價有兩種方法，一種方法是與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，使用待評估的項(xiàng)目對已知標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如定性檢測中用到的陽性參照品）進(jìn)行分析，將檢測結(jié)果與已知標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較；第二種方法是同時用待評估項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)方法（或參考方法）對同一批次樣品進(jìn)行分析，然后將不同方法得到的結(jié)果進(jìn)行對比分析。精密度是指重復(fù)檢測條件下，獲得的獨(dú)立測量結(jié)果間的一致程度，是對檢測體系隨機(jī)誤差的一種度量，常用標(biāo)準(zhǔn)差表示，標(biāo)準(zhǔn)差越小精密度越好。定性檢測的精密度還包括一份陽性或陰性樣本在多次檢測中，是否能得到可重復(fù)的陽性或陰性結(jié)果。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因變異檢測體系進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度等性能驗(yàn)證時所使用的參考物質(zhì)為各種突變型和野生型質(zhì)粒或突變細(xì)胞株。線性分析可直接分析已知濃度的樣品，也可將一定濃度的樣品進(jìn)行系列稀釋后，根據(jù)稀釋因子來研究檢測值與逐步下降的預(yù)期估計濃度之間是否存在線性?？蓤蟾娣秶悄軌驁蟾娴目煽康淖畹秃妥罡邫z測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室可通過“多點(diǎn)法”進(jìn)行簡單驗(yàn)證，推薦應(yīng)用5個不同濃度水平的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。LoD是指可被檢測體系檢出的最低檢測濃度，又稱最小檢測濃度或檢測底限。建立和驗(yàn)證LoD時，需同時建立、驗(yàn)證空白檢測限。檢出限一般由廠家、方法建立者完成，實(shí)驗(yàn)室LDT試劑應(yīng)確立方法的LoD。臨界值是鑒別樣品、作為判斷特定疾病、狀態(tài)或被測量物存在與否的界限的量值。測量結(jié)果高于臨界值判斷為陽性，低于臨界值判斷為陰性，接近臨界值判斷為非確定性。臨界值的選擇決定檢驗(yàn)的診斷特異性和診斷靈敏度。目前已有部分臨床治療指南將藥物靶點(diǎn)基因的mRNA表達(dá)水平高低（如ERCC1和RRM1）作為指導(dǎo)用藥的依據(jù)，然而目前對待測靶mRNA表達(dá)水平臨界值的確定尚未明確。分子診斷實(shí)驗(yàn)室可通過繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）確定診斷閾值，得到合適的敏感度和特異度。ROC曲線趨左上角靠近，曲線下面積就越大，其臨床檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性就越好。臨檢過程中應(yīng)按照試劑盒生產(chǎn)商的說明或定義定期對臨界值進(jìn)行評審。LDT試劑的性能評估包括樣品的類型與數(shù)量、所選擇的參比方法、評價指標(biāo)、準(zhǔn)確度、重復(fù)性與精密度、線性范圍、檢測范圍、分析的靈敏度與特異性、參考區(qū)間或cutoff值及臨床性能評估結(jié)果。具體可參考國家衛(wèi)計委《個體化醫(yī)學(xué)檢測LDT研制技術(shù)規(guī)范》。原則上按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。分析后質(zhì)量保證包括檢測報告、結(jié)果解釋