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正文內(nèi)容

油樟根、莖、葉總dna的提取畢業(yè)論文(編輯修改稿)

2024-08-23 06:12 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 A260/A280的比值2,說明油樟根莖葉的DNA質(zhì)量很低,有較嚴(yán)重的RNA污染。 改進(jìn)CTAB法所提取油樟根、莖、葉DNA紫外光譜結(jié)果及分析:  表32改進(jìn)CTAB法所提油樟根莖葉DNA紫外光譜分析表  A260(Abs)A280(Abs)A260/A280DNA濃度(μg/ml)DNA得率(μg/g)根175莖2500葉8413注:①據(jù)公式[DNA]=A260稀釋倍數(shù)50(181。g/ml)計算出:[DNA]根=175181。g/ml [DNA]莖=2500181。g/ml[DNA]葉=8413181。g/ml②據(jù)公式DNA得率(提取率)(μg/g材料鮮重)=DNA濃度/取材量(g)計算出:根DNA得率=莖DNA得率=葉DNA得率=結(jié)果分析:由表32看出,改進(jìn)CTAB法較常規(guī)CTAB法所提油樟根莖葉DNA質(zhì)量明顯提高,具體表現(xiàn)為DNA的濃度和純度大幅度提高:改進(jìn)CTAB法提取的油樟葉油樟A260/,說明油樟根莖葉的DNA質(zhì)量都比較高,無較大的RNA污染和蛋白質(zhì)污染;[DNA]根[DNA]莖[DNA]葉,根DNA得率莖DNA得率葉DNA得率。顯示在單一變量對照下,所提取油樟的根DNA的濃度和得率依次小于莖DNA的濃度和得率小于葉DNA的濃度和得率,說明提取油樟根DNA的難度大于莖DNA的難度大于葉DNA的濃度。 CTAB法的基本原理由于植物染色體DNA與組蛋白等結(jié)合成為脫氧核糖核蛋白復(fù)合體(deoxyribonuleoprotein, DNP),存在于細(xì)胞核中,因而,從細(xì)胞中提取DNA時,首先需要把DNP抽提出來,其次把蛋白質(zhì)除去,然后除去細(xì)胞中的糖,核糖核酸(RNA)及無機(jī)離子等,從中分離出DNA。DNP和核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響不同,DNP在高鹽溶液(≥)中可以穩(wěn)定存在,但如果降低鹽濃度,DNP的溶解度也隨之降低,當(dāng)鹽濃度≤,這時與CTAB結(jié)合的DNP就會沉淀出來。而RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小,在低鹽溶液中溶解度較大[11]。另外大部分的蛋白質(zhì)和多糖仍溶于溶液中,所以利用這個原理,我們不僅能分離DNP和RNP這兩種核蛋白,還能將大部分的蛋白質(zhì)和多糖除去,得到DNA粗提物。再經(jīng)過進(jìn)一步的純化,便可提取出高質(zhì)量的DNA。 幾種主要試劑的作用與對比 十六烷基三甲基溴化銨(cetyltriethlammoninum bromide,CTAB)是一種去污劑,它能與核酸形成復(fù)合物,并在低鹽溶液中將DNP沉淀出來,CTAB在15℃以下會沉淀,因此應(yīng)先將CTAB抽提液置于65℃水浴鍋中預(yù)熱[12]。 乙二胺四乙酸(EDTA):能螯合大多數(shù)核酸酶所需要的輔助因子—鎂離子。 β巰基乙醇:防止酚類氧化(酚類化合物能與DNA共價結(jié)合,使DNA帶棕色或褐色)。 聚乙烯吡咯烷烔(PVP):與酚類結(jié)合。 氯仿/異戊醇(24/1):去除蛋白質(zhì)。其中氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。異戊醇則有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫[13]。 異丙醇:沉淀核酸。沉淀DNA時用異丙醇而不用乙醇,而且小分子量DNA都能沉淀下來,用乙醇沉淀DNA時,只能有選擇地沉淀大分子量DNA[14]。要注意的是異丙醇不易揮發(fā),最好用80%的乙醇多洗幾次。 方法的探索及改進(jìn)針對常規(guī)CTAB法出現(xiàn)的問題所作的探索和采取的措施:%(W/V)PVP(聚乙烯吡咯烷烔):實驗發(fā)現(xiàn)在探索實驗中經(jīng)80%乙醇洗滌干燥后的沉淀仍略帶褐色,說明沉淀中仍然含有酚類雜質(zhì),而CTAB提取緩沖液中已經(jīng)加入了體積比高達(dá)4%的β巰基乙醇,CTAB沉淀液中也加入了2%(V/V)的的β巰基乙醇,說明僅僅靠β巰基乙醇防止酚類氧化是不夠的,還得用聚乙烯吡咯烷烔與之結(jié)合并除去酚類雜質(zhì);(24:1),而不使用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提:原因之一是在使用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提時,由于所加試劑體積大于實驗室50ml離心管體積(這也是試驗室能提供的最大容積的離心管),因此導(dǎo)致所加酚氯仿/異戊醇(25:24:1)的體積小于應(yīng)加的量,會造成蛋白質(zhì)污染;其次是因為酚本身就是一種雜質(zhì),用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提后的DNA沉淀顏色為褐色,而用氯仿/異戊醇(24:1)抽提的為白色,說明了用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提時造成了二次污染,故做此改進(jìn);,:,并且離心后倒掉的下層液體會污染環(huán)境;(即用TE緩沖液重懸時),加入2μl 1mg/mlRNaseA:用常規(guī)CTAB法提取的DNA有嚴(yán)重的RNA污染(如圖31所示),之所以確定是RNA污染,本研究做了以下探索:DNA是大分子物質(zhì),其分子量應(yīng)該在10000bp處。根據(jù)圖31分析可知,用常規(guī)CTAB法提取的DNA凝膠電泳圖譜在9399bp、9707bp 、10025bp處只有很模糊的條帶,而在2501500bp(屬于RNA的分子量的范疇)范圍內(nèi)卻有很明晰的條帶,據(jù)此初步判斷有RNA污染。另外,據(jù)查閱的資料[15]:所提取DNA的純度可用OD260和OD280的比值來評判。OD260/OD280對DNA而言,,,大于2時則RNA濃度過高,要去除RNA;當(dāng)OD260/OD280,則蛋白質(zhì)濃度過高,要用TE緩沖液飽和的酚/氯仿/異戊醇抽提,再用無水乙醇沉淀,抽干,TE緩沖液懸浮,最后用紫外分光光度計測定。表31進(jìn)一步說明了DNA樣品有嚴(yán)重RNA污染。因此在改進(jìn)CTAB法中,將實驗室的固體RNaseA配制成1mg/mlRNaseA溶液,向每個DNA樣品中加入2μl 1mg/mlRNaseA。 ,:在探索實驗中使用的是精密PH試紙測定EDTA,Tris堿的PH值,誤差很大,導(dǎo)致有幾次提取出來的干燥DNA沉淀都無法使用TE緩沖液重懸。因此本研究先將固體的EDTA,從而解決了該問題;℃儲存?zhèn)溆茫涸谔剿髟囼炛袑NA樣品置于20℃冰箱冷凍儲存,待取出來做分析時已經(jīng)凍結(jié),如此反復(fù)幾次后,凝膠電泳圖譜上的DNA條帶呈現(xiàn)彌散一片,這個現(xiàn)象說明了DNA已有部分降解,究其原因,應(yīng)該是將DNA反復(fù)凍融造成的。由于本研究提取出的只是微量DNA,不需要儲存很長的時間,因此,將DNA樣品置于4℃冰箱
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