油樟根、莖、葉總dna的提取畢業(yè)論文-在線瀏覽
2024-09-06 06:12本頁(yè)面
【正文】 /Nacl溶液（10%CTAB/）:,緩慢加入10gCTAB,同時(shí)加熱攪拌，如果需要，可加熱至65℃溶解[9]。（TAE）：A)50儲(chǔ)存液（）:,，,補(bǔ)加水至100mlB)1 工作液：40mmol/lTris：，,補(bǔ)加1 TAE至100ml。（根或莖）約3g,迅速放入離心管中，置于液氮罐中預(yù)冷。，加入12μl預(yù)熱的βME/CTAB，混合使之充分濕潤(rùn)。，用等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提，輕緩顛倒充分混勻，于4℃，12000rpm離心10min，回收上（水）相。，混勻，于4℃，12000rpm離心10min，回收上（水）相。，充分混勻，于4℃，12000rpm離心10min，沉淀DNA，用80%的乙醇洗滌沉淀物，干燥。%的瓊脂糖凝膠做電泳分析。具體操作程序如下（所有步驟為嚴(yán)格的無(wú)菌操作）：,使終濃度達(dá)4%（V/V）。lTE緩沖液中，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?、莖、葉DNA各7181。 油樟根、莖、葉DNA提取的比較方法本研究設(shè)置了單因素變量對(duì)照,從DNA的濃度和得率兩方面來(lái)對(duì)比評(píng)判提取油樟根莖葉DNA的難易程度，如表21:表21單因素變量法對(duì)比油樟根莖葉DNA選擇因子 根莖葉材料油樟根(2g)油樟莖(2g)油樟葉(2g)藥品相同相同相同儀器相同相同相同DNA提取方法相同相同相同凝膠電泳分析方法相同相同相同紫外光譜分析方法相同相同相同DNA濃度計(jì)算方法相同相同相同DNA得率計(jì)算方法相同相同相同 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果及分析 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果及分析：圖31 常規(guī)CTAB法提取的油樟根莖葉DNA凝膠電泳圖譜M:DL2000 1: 根DNA 2: 莖DNA 3: 葉DNA結(jié)果分析:由圖31可以看出,常規(guī)CTAB法提取的DNA質(zhì)量較差，表現(xiàn)為DNA樣品濃度較低，有嚴(yán)重的污染，說(shuō)明該方法有待改進(jìn)。 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果及分析：圖33 油樟根莖葉DNA的凝膠電泳圖譜 M：DL2000 1：根DNA 2：莖DNA 3：葉DNA結(jié)果分析:由圖33可以看出,DNA無(wú)降解也無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染，改進(jìn)CTAB法較常規(guī)CTAB法所提油樟根莖葉DNA質(zhì)量明顯提高，具體表現(xiàn)為DNA的濃度和純度大幅度提高；[DNA]根[DNA]莖[DNA]葉，表明在其他條件相同時(shí)，所提取油樟的根DNA的濃度小于莖DNA的濃度小于葉DNA的濃度，說(shuō)明提取油樟根DNA的難度大于莖DNA的難度大于葉DNA的濃度。g/ml）[10]計(jì)算出油樟根莖葉DNA濃度為:[DNA]根=[DNA]莖=875181。g/ml②據(jù)公式DNA得率(提取率)(μg/ g 材料鮮重)= DNA 濃度/取材量(g)計(jì)算出油樟根莖葉DNA得率為:根DNA得率=莖DNA得率=葉DNA得率=結(jié)果分析:由表31看出,常規(guī)CTAB法DNA質(zhì)量很差，具體表現(xiàn)為油樟根莖葉DNA的濃度和得率都很小，A260/A280的比值2，說(shuō)明油樟根莖葉的DNA質(zhì)量很低，有較嚴(yán)重的RNA污染。g/ml）計(jì)算出：[DNA]根=175181。g/ml[DNA]葉=8413181。顯示在單一變量對(duì)照下，所提取油樟的根DNA的濃度和得率依次小于莖DNA的濃度和得率小于葉DNA的濃度和得率，說(shuō)明提取油樟根DNA的難度大于莖DNA的難度大于葉DNA的濃度。DNP和核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響不同，DNP在高鹽溶液（≥）中可以穩(wěn)定存在，但如果降低鹽濃度，DNP的溶解度也隨之降低，當(dāng)鹽濃度≤，這時(shí)與CTAB結(jié)合的DNP就會(huì)沉淀出來(lái)。另外大部分的蛋白質(zhì)和多糖仍溶于溶液中，所以利用這個(gè)原理，我們不僅能分離DNP和RNP這兩種核蛋白，還能將大部分的蛋白質(zhì)和多糖除去，得到DNA粗提物。 幾種主要試劑的作用與對(duì)比 十六烷基三甲基溴化銨（cetyltriethlammoninum bromide,CTAB）是一種去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，并在低鹽溶液中將DNP沉淀出來(lái)，CTAB在15℃以下會(huì)沉淀，因此應(yīng)先將CTAB抽提液置于65℃水浴鍋中預(yù)熱[12]。 β巰基乙醇：防止酚類氧化（酚類化合物能與DNA共價(jià)結(jié)合，使DNA帶棕色或褐色）。 氯仿/異戊醇（24/1）：去除蛋白質(zhì)。異戊醇則有助于消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫[13]。沉淀DNA時(shí)用異丙醇而不用乙醇，而且小分子量DNA都能沉淀下來(lái)，用乙醇沉淀DNA時(shí)，只能有選擇地沉淀大分子量DNA[14]。 方法的探索及改進(jìn)針對(duì)常規(guī)CTAB法出現(xiàn)的問(wèn)題所作的探索和采取的措施：%（W/V）PVP（聚乙烯吡咯烷烔）：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在探索實(shí)驗(yàn)中經(jīng)80%乙醇洗滌干燥后的沉淀仍略帶褐色，說(shuō)明沉淀中仍然含有酚類雜質(zhì)，而CTAB提取緩沖液中已經(jīng)加入了體積比高達(dá)4%的β巰基乙醇，CTAB沉淀液中也加入了2%（V/V）的的β巰基乙醇，說(shuō)明僅僅靠β巰基乙醇防止酚類氧化是不夠的，還得用聚乙烯吡咯烷烔與之結(jié)合并除去酚類雜質(zhì)；（24：1），而不使用酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提：原因之一是在使用酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提時(shí)，由于所加試劑體積大于實(shí)驗(yàn)室50ml離心管體積(這也是試驗(yàn)室能提供的最大容積的離心管)，因此導(dǎo)致所加酚氯仿/異戊醇（25:24:1）的體積小于應(yīng)加的量，會(huì)造成蛋白質(zhì)污染；其次是因?yàn)榉颖旧砭褪且环N雜質(zhì)，用酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提后的DNA沉淀顏色為褐色，而用氯仿/異戊醇（24:1）抽提的為白色，說(shuō)明了用酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提時(shí)造成了二次污染，故做此改進(jìn)；，：，并且離心后倒掉的下層液體會(huì)污染環(huán)境；(即用TE緩沖液重懸時(shí))，加入2μl 1mg/mlRNaseA:用常規(guī)CTAB法提取的DNA有嚴(yán)重的RNA污染(如圖31所示)，之所以確定是RNA污染，本研究做了以下探索：DNA是大分子物質(zhì)，其分子量應(yīng)該在10000bp處。另外，據(jù)查閱的資料[15]：所提取DNA的純度可用OD260和OD280的比值來(lái)評(píng)判。表31進(jìn)一步說(shuō)明了DNA樣品有嚴(yán)重RNA污染。 ，：在探索實(shí)驗(yàn)中使用的是精密PH試紙測(cè)定EDTA，T
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1