【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 0mlB液：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液：（按生長(zhǎng)液配方配制，100ml中含下列液體） MEM 85ml 3% L谷氨酰胺 1ml %碳酸氫鈉 2ml HEPES 1ml 胎牛血清 10ml 青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體） MEM 93ml 3% L谷氨酰胺 1ml %碳酸氫鈉 2ml HEPES 1ml 胎牛血清 2ml 青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于2支凍存管中，一般每管應(yīng)在一次試驗(yàn)中用完，有剩余者應(yīng)廢棄；（2）加Eagle液10倍系列稀釋為101至108病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔50μl，每稀釋度4孔細(xì)胞；（3）每孔加細(xì)胞懸液50μl，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（50μl稀釋液+50μl細(xì)胞懸液）， 36℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變；（4）按BehrensK228。rber公式計(jì)算出分離病毒株的CCID50；log CCID50 = Ld (S )，其中：L = 實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值；d = 稀釋梯度的log值； S = 終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）。（5）正式試驗(yàn)前應(yīng)先滴定攻擊病毒2~3次，取其平均值， CCID50的病毒載量；（6）按照計(jì)算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗(yàn)所需的病毒總量（即100 CCID50/）；（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）；（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）（即10 CCID50/）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/ CCID50/。3．稀釋血清（1）發(fā)病1~3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2~4周采取恢復(fù)期血清，分別－20℃凍存?zhèn)錂z。（2）取無(wú)菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液），蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過(guò)夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。（3）打開(kāi)獨(dú)立無(wú)菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液），每份血清使用一排，每排4孔。（即為1：16），吹吸8~10次，（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過(guò)程中不必?fù)Q吸尖。即每份血清標(biāo)本進(jìn)行4倍倍比稀釋?zhuān)?：1：11：61：251：1024。（4）每份血清標(biāo)本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。4．病毒中和抗體測(cè)定的操作步驟：（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對(duì)）待測(cè)血清，版面設(shè)計(jì)如下圖所示。A1A2孔（B1BC1CD1DE1EF1FG1GH1H2）中每孔加入1:，不必?fù)Q吸尖，在A3A4孔（B3BC3CD3DE3EF3FG3GH3H4）中每孔加入1:，A5A6孔（B5BC5CD5DE5EF5FG5GH5H6）中每孔加入1:，A7A8孔（B7BC7CD7DE7EF7FG17GH7H8）中每孔加入1:，A9A10孔（B9BC9CD9DE9EF9FG9GH9H10）中每孔加入1:，A11A12孔（B11B1C11C1D11D1E11E1F11F1G11G1H11H12）為每份待測(cè)血清對(duì)照孔，；（2）（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100 CCID50/）；（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/（每次實(shí)驗(yàn)都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）， CCID50/，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/；同時(shí)留出4孔做為細(xì)胞對(duì)照孔，然后放入4℃冰箱中暫存；（5）在孵育期間，用消化液消化細(xì)胞，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的濃度為2105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準(zhǔn)備10ml；（6）孵育結(jié)束后每個(gè)待測(cè)血清孔、血清對(duì)照孔（待檢標(biāo)本板）和病毒回滴孔和細(xì)胞對(duì)照孔（病毒回滴板），然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點(diǎn)效價(jià)。當(dāng)100 CCID50/，判定最終結(jié)果（約5~7d）；（8）注意：如果病毒對(duì)照結(jié)果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，就要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。5．結(jié)果判定：當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細(xì)胞病變，另1孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。對(duì)于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)，如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽(yáng)性。（三）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）1．RNA提取可使用商業(yè)化試劑盒來(lái)提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA；（1），（含Carrier RNA）；（2），再向這支離心管中加入140μl臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物，充分混勻至少15s；（3），室溫下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬時(shí)離心；（4），加入560μl純酒精，充分混勻至少15s，瞬時(shí)離心；（5），小心加入約630μl的混合溶液至QIAamp柱中（試劑盒附帶），將QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm離心5s，使液體通過(guò)濾膜；（6），棄去收集管中的液體，重復(fù)第6步驟；（7），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW1緩沖液，8000 rpm離心5s，使液體通過(guò)濾膜；（8），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW2緩沖液，8000 rpm離心5s，使液體通過(guò)濾膜；（9），棄去收集管中的液體，13000 rpm再次離心1min；（10），；（11），向膜上加入40μl的EB緩沖液，然后室溫下靜置2~5min；（12），在離心機(jī)中以8000 rpm的速度離心1min，離心下來(lái)的液體即為所需的核酸溶液。2．RTPCR擴(kuò)增（1）引物序列合成1）人腸道病毒（包括EV7CA16）核酸檢測(cè)通用引物序列：PE2（上游）：5` TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 3`PE1（下游）：5` ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 3`2）EV71核酸檢測(cè)引物序列：EV71S（上游）：5` GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 3`EV71A（下游）：5` ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 3`3）CA16核酸檢測(cè)引物序列：Cox A16S（上游）：5`ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC3`Cox A16A（下游）；5`TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG3`（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）在PCR記錄紙（實(shí)驗(yàn)記錄紙）上記錄本次實(shí)驗(yàn)操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期，所鑒定標(biāo)本的名稱(chēng)以及標(biāo)本的順序，與PCR儀排列的順序一致。2）標(biāo)記好加標(biāo)本和對(duì)照的PCR管（陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和試劑對(duì)照）。A：陽(yáng)性對(duì)照：無(wú)感染性的對(duì)照RNA。B：細(xì)胞對(duì)照：使用未接種病毒的細(xì)胞懸液，最好使用與擴(kuò)增病毒所用的細(xì)胞類(lèi)型與代數(shù)相同的細(xì)胞。每一次實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)細(xì)胞對(duì)照。C：試劑對(duì)照：用去離子水代替標(biāo)本。（3）RTPCR擴(kuò)增 1