醫(yī)學(xué)標(biāo)本采集和保存技術(shù)要求表doc-閱讀頁(yè)
2025-08-01 18:42本頁(yè)面
【正文】 血清（1）發(fā)病1~3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2~4周采取恢復(fù)期血清，分別－20℃凍存?zhèn)錂z。次日56℃、30min滅活。（即為1：16），吹吸8~10次，（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過(guò)程中不必?fù)Q吸尖。（4）每份血清標(biāo)本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。A1A2孔（B1BC1CD1DE1EF1FG1GH1H2）中每孔加入1:，不必?fù)Q吸尖，在A3A4孔（B3BC3CD3DE3EF3FG3GH3H4）中每孔加入1:，A5A6孔（B5BC5CD5DE5EF5FG5GH5H6）中每孔加入1:，A7A8孔（B7BC7CD7DE7EF7FG17GH7H8）中每孔加入1:，A9A10孔（B9BC9CD9DE9EF9FG9GH9H10）中每孔加入1:，A11A12孔（B11B1C11C1D11D1E11E1F11F1G11G1H11H12）為每份待測(cè)血清對(duì)照孔，；（2）（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100 CCID50/）；（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/（每次實(shí)驗(yàn)都必須做）。當(dāng)100 CCID50/，判定最終結(jié)果（約5~7d）；（8）注意：如果病毒對(duì)照結(jié)果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，就要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)，如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽(yáng)性。2．RTPCR擴(kuò)增（1）引物序列合成1）人腸道病毒（包括EV7CA16）核酸檢測(cè)通用引物序列：PE2（上游）：5` TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 3`PE1（下游）：5` ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 3`2）EV71核酸檢測(cè)引物序列：EV71S（上游）：5` GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 3`EV71A（下游）：5` ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 3`3）CA16核酸檢測(cè)引物序列：Cox A16S（上游）：5`ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC3`Cox A16A（下游）；5`TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG3`（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）在PCR記錄紙（實(shí)驗(yàn)記錄紙）上記錄本次實(shí)驗(yàn)操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期，所鑒定標(biāo)本的名稱以及標(biāo)本的順序，與PCR儀排列的順序一致。A：陽(yáng)性對(duì)照：無(wú)感染性的對(duì)照RNA。每一次實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)細(xì)胞對(duì)照。（3）RTPCR擴(kuò)增 1）在冰面上融化病毒標(biāo)本和各種PCR試劑； 2）配下列試劑主溶液：10PCR Buffer上游引物（）RNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）Taq DNA聚合酶（5U/μl） 3）在PCR儀上進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：42℃45min95℃3min95℃20s45℃25s 32個(gè)循環(huán) 72℃30s72℃10min 4℃Soak3．電泳分析1）將已經(jīng)聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 電泳載樣緩沖液（每個(gè)反應(yīng)需1μl）。如果儲(chǔ)存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復(fù)使用；7）在蒸餾水中涮一下凝膠；8）在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，并照相作記錄。RTPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋表待檢標(biāo)本RTPCR結(jié)果鑒定結(jié)果所有引物（－）非腸道病毒（NEV）EV（＋），EV71（－），CA16（－）非EV7CA16的其它腸道病毒EV（＋），EV71（＋），CA16（－）EV71EV（＋），EV71（－），CA16（＋）CA16五、生物安全根據(jù)2006年1月11日衛(wèi)生部制訂的《人間傳染的病原微生物名錄》，柯薩奇病毒、?？刹《?、腸道病毒 71型和目前分類未定的其它腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。操作糞便、腦脊液和血液等臨床標(biāo)本時(shí)要特別注意生物安全，要在II級(jí)生物安全柜中進(jìn)行標(biāo)本處理、病毒分離和病毒鑒定，無(wú)脊灰疫苗免疫史的人員要進(jìn)行脊灰疫苗免疫。所有操作應(yīng)遵守國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)。預(yù)后：痊愈/好轉(zhuǎn)/未愈/死亡/其他 ；后遺癥（有， ；無(wú)）三、臨床情況（一）臨床癥狀 如有請(qǐng)打“√”發(fā)熱（有， ℃/ 無(wú)）； 皮疹（有，主要部位： / 無(wú)）口腔炎：口腔粘膜上出現(xiàn)紅色潰瘍型皰疹 是 □ 否 □呼吸系統(tǒng)：流涕 □ 咳嗽 □ 咽痛 □ 其他：__________________________消化系統(tǒng)： 惡心 □ 嘔吐 □ 腹痛 □ 腹瀉 □ 其他：_______________神經(jīng)系統(tǒng)：頭痛□ 噴射狀嘔吐□ 精神異?！?嗜睡□ 意識(shí)障礙□ 昏迷□ 驚厥□心血管系統(tǒng)：心律失常：有 □ 無(wú) □（二）體征頸項(xiàng)強(qiáng)直：有 □ 無(wú) □； 巴氏癥：有 □ 無(wú) □；克氏癥：有 □ 無(wú) □； 布氏癥：有 □ 無(wú) □腱反射： 正常 □ 亢進(jìn) □ 減弱 □；肌張力：正常 □ 亢進(jìn) □ 減弱 □（三）輔助檢查血象：有，無(wú)。包括（填寫(xiě)）家人、親戚、同班、同校、同村或其它等關(guān)系。（二）病例密切接觸者，患者發(fā)病前7天以來(lái)，接觸的人群情況患者的密切接觸者德情況密接姓名性別年齡與患者關(guān)系發(fā)病是否發(fā)病時(shí)間接觸時(shí)間（起止）住院是否臨床診斷備注：接觸患者的密切人員與患者關(guān)系，填寫(xiě)家人、親戚、同班、同校、同村或其它等關(guān)系。（三）發(fā)病6天前是否到過(guò)手足口病流行地（是，時(shí)間 ，地點(diǎn) /否/不詳）。在與患者接觸后，觸摸眼、口、鼻前，打噴嚏或咳嗽后，如廁后，帶口罩前及摘口罩后，接觸公共設(shè)施如扶手、門柄、電梯按鈕、公共電話后、從外面回家后等均應(yīng)及時(shí)洗手。一、濕在水龍頭下把手淋濕，擦上肥皂或洗手液。三、沖用清水把手沖洗干凈。五、擦用干凈的毛巾/紙巾擦干或烘干機(jī)烘干。（二）只需要對(duì)經(jīng)常接觸的物體表面（如門把手、課桌椅、餐桌、嬰兒床欄桿、樓梯把手等）、玩具、游樂(lè)設(shè)施、寢具及書(shū)本等做重點(diǎn)性消毒。二、消毒方法的適用（一）糞便：可用生石灰以1:1的比例與其攪拌均勻消毒。（三）生活用具、玩具、校舍、書(shū)籍：用500毫克/升含氯消毒劑溶液擦拭消毒，作用時(shí)間30分鐘，%過(guò)氧乙酸作用60分鐘，或用紫外線燈直接照射30分鐘。（五）盛放排瀉物的容器：用500毫克／升有效氯含氯消毒劑浸泡120分鐘。（七）滅蠅：可用5%氯氰菊酯（奮斗吶）、%溴氰菊酯或其他殺蟲(chóng)劑，按說(shuō)明書(shū)使用。（九）垃圾：用1000毫克/升有效氯含氯消毒劑溶液噴霧作用12
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