【正文】 出院日期 年 月 日，出院診斷 病程 天預(yù)后：痊愈/好轉(zhuǎn)/未愈/死亡/其他 ；后遺癥（有， ；無）標(biāo)本統(tǒng)一編號：標(biāo)本類型采樣日期送檢日期是否冷藏標(biāo)本量收樣日期檢測日期報(bào)告日期實(shí)驗(yàn)結(jié)果RDHEp2中和抗體滴度咽拭子血清急性期恢復(fù)期糞便標(biāo)本腦脊液皰疹液注：送檢標(biāo)本編號為“標(biāo)本統(tǒng)一編號+標(biāo)本類型”，其中“T”為咽拭子代碼， “S1”為急性期血清代碼，“S2” 為恢復(fù)期血清代碼，“F”為糞便標(biāo)本代碼，“CSF”為腦脊液代碼，“H”為皰疹液代碼。手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測原則和程序手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合適的臨床標(biāo)本，或無法進(jìn)行病毒分離，也可以通過血清學(xué)檢測（如中和實(shí)驗(yàn)）來檢測血清中的中和抗體，或直接從臨床標(biāo)本中檢測病毒的核酸來診斷（見下圖：手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷流程圖）。病毒分離成功后，送至國家參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定或復(fù)核，同時(shí)對全國手足口病的病原進(jìn)行病毒學(xué)監(jiān)測。很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細(xì)胞系對不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時(shí)期腸道病毒的流行株也不同。使用血清型特異性的中和抗血清進(jìn)行的中和實(shí)驗(yàn)是腸道病毒鑒定的基本方法，如果使用了適當(dāng)?shù)目寡?，?shí)驗(yàn)結(jié)果是比較可靠的。當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標(biāo)本時(shí)，血清學(xué)檢測可以為腸道病毒的感染提供一個(gè)間接的證據(jù)。但是，無癥狀的腸道病毒感染也是常見的，所以對檢測結(jié)果的解釋要慎重一些。目前，用分子生物學(xué)方法對腸道病毒進(jìn)行定型還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，而且要根據(jù)檢測目的選擇使用適用的方法。當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離或未分離到病毒時(shí)，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。腸道病毒有時(shí)引起無癥狀感染，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義應(yīng)結(jié)合臨床過程和流行病學(xué)資料進(jìn)行解釋。一、標(biāo)本采集對象標(biāo)本采集對象是暴發(fā)疫情出現(xiàn)時(shí)手足口病的臨床診斷病例和病例發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無病例的社區(qū)（村）或托幼機(jī)構(gòu)的5歲以下的兒童（作為健康對照人群）。對于血清學(xué)診斷，需要在急性期和恢復(fù)期采集雙份血清標(biāo)本。標(biāo)本應(yīng)冷凍運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)要附有必要的信息，如標(biāo)本編號、發(fā)病日期和標(biāo)本采集日期。糞便標(biāo)本采集量5~8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。（三）血清標(biāo)本采集急性期（發(fā)病0~3d）和恢復(fù)期（發(fā)病14~30d）雙份配對血清用于抗體檢測。（四）皰疹液在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒具有很高的診斷價(jià)值，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。所采集標(biāo)本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，~。（六）病例密切接觸者的標(biāo)本采集選擇典型病例所在的托幼機(jī)構(gòu)、或所在村，以新發(fā)病例密切接觸者為采樣對象，采集單份糞便和血清標(biāo)本。采集5歲以下的兒童單份糞便和血清標(biāo)本。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防干燥。為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。對于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。2．病毒分離細(xì)胞系許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV7CA16）生長。 RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。 HEp2細(xì)胞，來源于人喉癌上皮細(xì)胞。（2）皰疹液標(biāo)本的處理皰疹液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，然后在4℃條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過濾除菌。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后3d左右形成；（2）倒掉生長液（GM），換上1~（MM）；（3）每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對照；（5），培養(yǎng)溫度要求36℃（對于AHC標(biāo)本的病毒分離，尤其是EV70的分離培養(yǎng)，強(qiáng)烈建議降低培養(yǎng)溫度，一般可為34~35℃）；（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+~4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，25%。 3+, 50%~75%。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用于進(jìn)一步的鑒定；（9）第1代培養(yǎng)見可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后－20℃或－70℃凍存；（10）一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。（11）如果7d之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。取100μl陽性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標(biāo)本吸咐1h后用維持液清洗細(xì)胞層，可能會(huì)降低毒性反應(yīng)。這些已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在－20℃凍存，（此時(shí)是第二代）。這時(shí)應(yīng)被認(rèn)為是第一代。重新取原始標(biāo)本，用氯仿處理，按上述步驟重新接種到新鮮細(xì)胞上。這時(shí)已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在－20℃凍存，再觀察7~10d。5．病毒分離結(jié)果解釋：RD細(xì)胞支持HFMD的主要病原體——CA16和EV71的復(fù)制，CA16和EV71均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落。若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其它可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等臨床標(biāo)本中分離出病毒有診斷價(jià)值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。（二）測定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度比較患者急性期血清與恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗(yàn)，即用微量板法測定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。但是，不明顯的腸道病毒感染（隱性感染）也很常見，所以在評估檢測結(jié)果時(shí)就要小心一些。使用對腸道病毒敏感的細(xì)胞，如RD細(xì)胞。中和實(shí)驗(yàn)的檢測原理：病毒感染敏感靶細(xì)胞后，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），特異性中和抗體與病毒結(jié)合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。rber公式計(jì)算出分離病毒株的CCID50；log CCID50 = Ld (S )，其中：L = 實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值；d = 稀釋梯度的log值； S = 終判時(shí)陽性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）。3．稀釋