臨床pcr檢驗標本的采集、處理、保存及核酸提取方法-在線瀏覽
2024-08-28 04:49本頁面
【正文】 溫育 40min 20220g室溫離心 5min取 5ul用于 PCR擴增 痰標本處理簡單模式 ? 試劑：（ 1）裂解液 :含終濃度 mol/L NaOH、 50μg蛋白酶 K和 % Triton X100 50ul痰 6000g離心 10分鐘，棄上清 加入裂解液 50ul， 60℃ 溫育 30min 90℃ 溫育 30min 加入 TrisHCl中和以上反應(yīng)混合物 取 5ul用于 PCR檢測 痰標本處理中要注意的問題 ? 痰標本在沒有加入內(nèi)標以控制假陰性的情況下，不能采用異硫氰酸胍鹽（ GuSCN）方法提取。 ? 在 PCR主反應(yīng)混合液中，加入 α酪蛋白（ alphacasein）、白蛋白等，有防止此類抑制物產(chǎn)生的效果。 ? 如不立即用于核酸提取 ,則需保存于 70℃ 下 . 膿液 ? 膿液的處理依情況而定 ,如用于分枝桿菌 (如結(jié)核桿菌 )核酸測定的標本 ,粘稠的膿液可采用痰標本的處理模式 ， 先進行液化 ， 再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心 ,沉淀用生理鹽水洗 2～ 3次后 ,即可用于 DNA提取 。如為水樣 ,則按上述直接離心取沉淀即可 。 體液 ?臨床體液標本包括胸水 ,腹水 ,腦脊液 ,尿液等 ,可按水樣標本的方式離心取沉淀后 ,提取核酸 。 乳汁 ? 乳汁有時也可作為標本，如乳汁中 HBV DNA、 HCV RNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等的 PCR檢測。 ②玻璃珠：（直徑： 425600um） 乳汁標本離心 6000rpm， 5min，棄上清 脂質(zhì)和沉淀用 750ul裂解液重懸 重懸液移入含 100mg玻璃珠離心管攪拌 煮沸 5min，離心 14000rpm， 3min 650ul上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，等體積異丙醇沉淀 70%乙醇洗滌沉淀，干燥 50ul TrisEDTA溶解沉淀即可用于 PCR擴增 組織 ? 組織有新鮮組織塊和石蠟切片 。 ? 新鮮組織最好是保存于 50%乙醇中 ,具體作法是 ， 先用生理鹽水將組織洗一次 ,切成寬度小于 1cm的小片 ,加入適量的生理鹽水 ,然后 ,邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為 50%.這樣固定的組織標本室溫下可保存數(shù)日 ,4℃ 可保存 6年 。 臨床標本的濾紙上保存 ? 臨床標本置于經(jīng)過處理的濾紙片上，如靶核酸為 DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。 ? 不管是全血、血清（漿）。 臨床標本中 PCR反應(yīng)抑制物 ? 內(nèi)源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。 肝素的作用機理 ? 肝素對 MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和 TAQ DNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中， 標本中的肝素可結(jié)合于 DNA和RNA上 ，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。 肝素的作用機理 ? 每 μg核酸標本中加入 ,即可 100%的抑制酶活性。 血紅蛋白、乳鐵蛋白 ? 血紅蛋白和乳鐵蛋白 分別是 紅細胞 和 白細胞 內(nèi)的主要 PCR抑制物 ,它們均含有鐵。研究鐵的抑制效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)其干擾 DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（ Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是 PCR抑制物。 去除或減輕抑制的一些方法 ? 加入 % (wt/vol)牛血清白蛋白（ BSA）可降低血液對 Taq DNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在 2%（ vol/vol）血液存在下亦可成功擴增，而通常血液含量只能是 %。 ? 單鏈 DNA結(jié)合 T4基因 32蛋白（ gp32）有類似 BSA的增強效應(yīng)。 ? 傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。 ? 一般均使用去垢劑 (如 Triton100)裂解細胞，用一種蛋白裂解酶 (如蛋白酶 K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核
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