核酸提取原理及方法-在線瀏覽
2025-01-25 10:17本頁面
【正文】 romide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。 2022年 7月 基因組 DNA提取 —— CTAB法 ? CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 TrisHCl （ pH ） EDTA （ pH ） NaCl CTAB β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM M 2% (W/V) %（ V/V）使用前加入 ? TrisHCl （ pH ）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； ? EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase活性； ? NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使 DNP充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； ? β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。 2022年 7月 ? CTAB法實驗流程 基因組 DNA提取 —— CTAB法 植物材料 抽提 核酸沉淀 液氮研磨 上層溶液 細胞裂解 DNA溶液 干燥溶解 離心洗滌 2022年 7月 ? SDS法原理 ? SDS是一種陰離子去垢劑 ， 在高溫 （ 55～ 65℃ ） 條件下能裂解細胞 ，使染色體離析 ， 蛋白變性 ， 釋放出核酸； ? 提高鹽 (KAc或 NH4Ac)濃度并降低溫度 （ 冰浴 ） ， 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 ， 離心后除去沉淀； ? 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提 ， 反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。如動物組織、細胞、全血、細菌、酵母等。 2022年 7月 基因組 DNA提取 —— SDS法 ? SDS法實驗流程（以動物組織為例） 動物組織 抽提 酒精沉淀 液氮研磨 或勻漿 上層溶液 細胞裂解 DNA溶液 干燥溶解 離心洗滌 2022年 7月 基因組 DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測 小鼠 gDNA電泳圖 瓊脂糖凝膠電泳： 以瓊脂糖凝膠作為支持物，利用 DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取及檢測 —— 實驗準備 臺式高速離心機、旋渦混合儀、移液器、定時器、 marker筆、 電子天平、電泳設備、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。 質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型， YRBIO) 、 LB培養(yǎng)基、抗生素、 瓊脂糖、 DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE電泳緩沖液等。 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題 ? RNA殘留 ? 質(zhì)粒斷裂 ? 量少 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題分析 ? RNA殘留 ? 忘記加 RNase A？ ? I液中 RNase A失效？ ? 酶量不夠？ 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題分析 ? 質(zhì)粒斷裂 ? II 液裂解時間過長？ ? 裂解時動作過于劇烈？ 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題分析 ? 量少 ?凝膠是否有問題？ ?菌體量少 ?菌體重懸不徹底 ?裂解不完全 ?菌株老化 ?嚴謹型質(zhì)粒 2022年 7月 質(zhì)粒類型 ? 嚴謹型： 這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下進行的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。如較早的質(zhì)粒 pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。而在酸性條件下，磷酸基的負電荷消失，水溶性下降。 2022年 7月 TRIzol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使 RNA與蛋白質(zhì)分離，并將 RNA釋放到溶液中。水相層主要為 RNA，有機層主要為 DNA和蛋白質(zhì)。 mL EP管（ RNase free）、各規(guī)格 Tip （ R
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