【正文】 物，充分混勻至少15s；（3），室溫下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬時(shí)離心；（4），加入560μl純酒精，充分混勻至少15s，瞬時(shí)離心；（5），小心加入約630μl的混合溶液至QIAamp柱中（試劑盒附帶），將QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm離心5s，使液體通過濾膜；（6），棄去收集管中的液體，重復(fù)第6步驟；（7），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW1緩沖液，8000 rpm離心5s，使液體通過濾膜；（8），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW2緩沖液，8000 rpm離心5s，使液體通過濾膜；（9），棄去收集管中的液體，13000 rpm再次離心1min；（10），；（11），向膜上加入40μl的EB緩沖液，然后室溫下靜置2~5min；（12），在離心機(jī)中以8000 rpm的速度離心1min，離心下來的液體即為所需的核酸溶液。5．結(jié)果判定：當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細(xì)胞病變，另1孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）， CCID50/，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/；同時(shí)留出4孔做為細(xì)胞對照孔，然后放入4℃冰箱中暫存；（5）在孵育期間，用消化液消化細(xì)胞，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的濃度為2105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準(zhǔn)備10ml；（6）孵育結(jié)束后每個(gè)待測血清孔、血清對照孔（待檢標(biāo)本板）和病毒回滴孔和細(xì)胞對照孔（病毒回滴板），然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點(diǎn)效價(jià)。4．病毒中和抗體測定的操作步驟：（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對）待測血清，版面設(shè)計(jì)如下圖所示。即每份血清標(biāo)本進(jìn)行4倍倍比稀釋，即1：1：11：61：251：1024。（3）打開獨(dú)立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液），每份血清使用一排，每排4孔。（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液），蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。（5）正式試驗(yàn)前應(yīng)先滴定攻擊病毒2~3次，取其平均值， CCID50的病毒載量；（6）按照計(jì)算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗(yàn)所需的病毒總量（即100 CCID50/）；（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）；（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）（即10 CCID50/）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/ CCID50/。1．液體配制A液：血清處理液：（100ml中含下列液體） MEM 85ml 3% L谷氨酰胺 1ml %碳酸氫鈉 2ml 胎牛血清 2ml 青、鏈霉素（各10000U/ml） 10mlB液：細(xì)胞營養(yǎng)液：（按生長液配方配制，100ml中含下列液體） MEM 85ml 3% L谷氨酰胺 1ml %碳酸氫鈉 2ml HEPES 1ml 胎牛血清 10ml 青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體） MEM 93ml 3% L谷氨酰胺 1ml %碳酸氫鈉 2ml HEPES 1ml 胎牛血清 2ml 青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于2支凍存管中，一般每管應(yīng)在一次試驗(yàn)中用完，有剩余者應(yīng)廢棄；（2）加Eagle液10倍系列稀釋為101至108病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔50μl，每稀釋度4孔細(xì)胞；（3）每孔加細(xì)胞懸液50μl，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照（50μl稀釋液+50μl細(xì)胞懸液）， 36℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變；（4）按BehrensK228。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因?yàn)槭怯貌《緛泶_定血清（CSF）中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時(shí)使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，當(dāng)然，分離株的滴度（100 CCID50/）要事先測定。在中和實(shí)驗(yàn)中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CA16原型株為G10株），有時(shí)同時(shí)（或單獨(dú)）使用臨床分離株會(huì)有助于得到更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清（或腦脊液）中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復(fù)分離到同一型病毒，且從周圍患同樣疾病者中也檢出相同的病毒，且病毒分離率遠(yuǎn)高于正常人群，則有診斷的參考價(jià)值。但CA16和EV71在HEp2細(xì)胞中均不繁殖。但相同滴度的CA16和EV71在RD細(xì)胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CA16早，EV71接種細(xì)胞后出現(xiàn)CPE很快，但CA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。如果盲傳兩代后仍然沒有產(chǎn)生CPE，那么認(rèn)為這個(gè)標(biāo)本是陰性的。 C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細(xì)胞會(huì)老化，甚至細(xì)胞對照也出現(xiàn)了病變。 B：微生物污染：由于細(xì)菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細(xì)胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。如果又出現(xiàn)了毒性反應(yīng)，那么應(yīng)該取原始標(biāo)本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細(xì)胞中。（14）幾個(gè)概念： A：毒性反應(yīng)：如果在接種后1~2d內(nèi)細(xì)胞快速地調(diào)亡，這可能是由于標(biāo)本中含有毒性物質(zhì)而導(dǎo)致的非特異性毒性反應(yīng)。（注意：同一病例標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細(xì)胞的培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)傳代）；（12）盲傳2代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；（13）注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，很可能是標(biāo)本中的非特異性成分導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以選用二代病毒進(jìn)行鑒定。 4+, 75%~100%）；（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實(shí)記錄，并觀察直到75%的細(xì)胞發(fā)生變化（3+ CPE），然后儲(chǔ)藏在－20℃以備二次傳代。 2+, 25%~50%。4．接種和觀察（病毒分離）（1）顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康的。（3）腦脊液標(biāo)本的處理腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。