【文章內(nèi)容簡介】 過指紋圖譜主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對穩(wěn)定。因此，在有效成分不完全明確的前提下，特定中藥材或中成藥的質(zhì)量控制有重要意義?！　∧壳埃讣y圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段。我們要借助分析手段的進(jìn)步，推進(jìn)指紋圖譜研究，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化，產(chǎn)業(yè)化，使中藥早日走向世界。 第 二 章 對照品的分離與結(jié)構(gòu)鑒定第一節(jié) 對照品的分離、純化1. 分離材料與試劑Sephadex–LH20 (日本)RP–C18 (日本 株式會社)薄層層析硅膠H(60型) (青島海洋化工)高效薄層板Kiestlge160F254 (德國 Merck公司)反相薄層板Rp–C18 (德國 Merck公司)甲醇(分析純) (北京化工廠)氯仿(分析純) (天津化學(xué)試劑二廠)2. 儀器：Waters制備液相 W?600型。質(zhì)譜儀 JMS?DX302型。核磁共振光譜儀 ZY?400G型。檢測器UV ?2961型。柳本熔點(diǎn)儀(溫度未校正)。3. 對照品的分離及純化　　取有效部位，進(jìn)行硅膠柱色譜，依次用氯仿:甲醇10:1，5:1，3:1進(jìn)行洗脫，取氯仿:甲醇3:1洗脫部分進(jìn)行Sephadex柱色譜，以甲醇:水洗脫。取4:6部分上Rp–C18柱色譜，甲醇:水洗脫，取2:8部位,經(jīng)制備液相純化 ，得一淡黃色粉末，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)為單體化合物(1)。由于該化合物是洋金花有效部位中的主要化學(xué)成分，故擬以此化合物作為用于洋金花及其制品質(zhì)量評價等的對照品。第二節(jié) 對照品的結(jié)構(gòu)鑒定　　化合物1為淡黃色粉末，難溶于氯仿，溶于甲醇、乙醇，易溶于二甲基亞砜和水。Molish反應(yīng)陽性,鹽酸鎂粉反應(yīng)陽性，二氯氧鋯枸櫞酸反應(yīng)黃色褪去。酸水解后，其糖部分經(jīng)薄層色譜檢識證明含有葡萄糖和鼠李糖，苷元部分經(jīng)薄層色譜檢識證明為山柰酚。推測其為山柰酚與葡萄糖和鼠李糖組成的黃酮苷類化合物?！　』衔?的快原子轟擊質(zhì)譜(FAB+)在m/z757處可見準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，表明其分子量為756?！　』衔?的1H–NMR譜中，歸屬于苷元部分A環(huán)的母核質(zhì)子只有2個，(1H,d,J=)處的H?(1H,d,J= HZ)處的H?6。因此，推測其A環(huán)有5,7–二氧取代基存在。歸屬于苷元部分B環(huán)的母核質(zhì)子共有4個，(2H,d,J=)處的H–2′和H–6′(2H,d,J=)處的H–3′和H–5′。根據(jù)B環(huán)的質(zhì)子數(shù)目和相互間的偶合情況，可推測其B環(huán)的4′位有含氧取代基存在。其1H–NMR中提供的苷元部分結(jié)構(gòu)信息與山柰酚酸水解結(jié)果和13C–NMR譜的支持。在1H–NMR譜中。(1H,d,J=) (1H,d,J=)處可見2個歸屬于葡萄糖端基質(zhì)子的信號，(1H,d,J=)處可見有歸屬于鼠李糖端基質(zhì)子的信號。(3H,d,J=)處可觀察到1個歸屬于鼠李糖6位的甲基的二重峰信號。 在化合物1的13C–NMR譜中，除歸屬于山柰酚母核的15個碳信號外，可觀察到2個歸屬于葡萄糖端基碳原子的信號()，1個歸屬于鼠李糖端基碳原子的信號()和1個歸屬于鼠李糖6位甲基碳原子的信號()。將化合物1的苷元部分的碳信號數(shù)據(jù)與山柰酚進(jìn)行對照，發(fā)現(xiàn)其C?2和C?，表明在C?3位與糖成苷。同時，可見C?，而C?6和C?，表明C?7位也與糖成苷。 　根據(jù)1H–NMR譜中2個葡萄糖端基質(zhì)子信號的偶合常數(shù)分別為7 HZ，推斷該葡萄糖苷鍵均為β構(gòu)型。–NMR中的化學(xué)位移，推斷其苷鍵為α構(gòu)型。此外，將化合物1的13C–NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的3Oglc7Orha山柰酚和3Oglc(1→2)glc山柰酚相對照(見Table1)，其相對應(yīng)碳的化學(xué)位移基本一致。綜合以上分析，化合物1被鑒定為3OβD葡萄吡喃糖基(1→2)葡萄吡喃糖基7OαL鼠李吡喃糖基山柰酚(見Fig1)。 Fig 1 Structre of Compound 1 Table 1 13C?NMR Data of Compound 1 (DMSO–d6) NO.δcKaempferol3Oglc7OrhaKaempferol3Oglc(1→2) glcKaempferolCompound 1 2 3456789101′2′3′4′5′6′3Oglc1′′2′′3′′4′′5′′6′′glc1′′′2′′′3′′′4′′′5′′′6′′′7Orha1′′′′2′′′′3′′′′4′′′′5′′′′6′′′′第三章 洋金花治療銀屑病有效部位的含量測定第一節(jié) 有效部位總黃酮的含量測定1. 儀器與試藥 儀器:UV?1601型分光光度計　　　　　　 （日本島津公司）　　　電子天平　　　 （上海梅特勒—托利多儀器有限公司） 酸度計PHS?25C型 （上海康儀儀器有限公司） 試藥:甲醇（分析純）　　　　　　　　　　 （北京化工廠）2. 供試品的制備　　取有效部位用甲醇溶解，定容至200ml，制成供試品溶液。3. 最大吸收波長的確定　　取對照品溶液與供試品溶液，分別進(jìn)行紫外全波長掃描，得紫外吸收光譜(見Fig2)。Fig2 UV Chromatogram of standard and sample solution因其均在268nm有最大吸收，所以確定為檢測波長。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備　　，,　，，，以此為對照溶液，在268nm下測其吸收度，測定結(jié)果見表Table2Table 2 Linear Relationship of Standard Material　NO. 　contents of standard materal(mg/l) A　　1 2 3 4 5 6 對對照品的吸收度和濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=+ γ = (A:吸收度，C:濃度)~。　　以對照品的濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見Fig3。Fig3 normal curve of standard material5. 精密度實(shí)驗(yàn)　　精密稱取對照品1mg，甲醇溶解并定容至50ml，連續(xù)重復(fù)測定5次時，測定結(jié)果見Table3。Table 3 Result of precision experiment of the method (n=5)　NO. 　 1 2 3 4 5A 　A RSD% 由表3可知，測定結(jié)果的RSD%＝%，表明儀器系統(tǒng)的精密度高。6. 穩(wěn)定性試驗(yàn)　　，甲醇溶解并定容至200ml，對此樣品于紫外下每隔一小時測定一次，測其吸收度，結(jié)果見Table4。Table 4 Result of stability experiment of the method (n=5)NO. 1 2 3 4 5A A RSD% 由表4可知，測定結(jié)果的RSD%＝%，表明樣品在5小時內(nèi)穩(wěn)定。7. 重現(xiàn)性試驗(yàn)　　取洋金花有效部位精密稱取5份，甲醇溶解并定容至200ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸收度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見Table5。Table 5 Result of preproducibility experiment of the method (n=5)NO. 1 2 3 4 5A A RSD% 由表5可知，測定結(jié)果的RSD%＝%，表明該方法重現(xiàn)性好。8. 加樣回收率試驗(yàn)　　精密稱取五份樣品，用甲醇溶解并定容至200ml，測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。另精密稱取五份樣品，分別加入精密稱取的對照品，用甲醇溶解并定容至200ml，測定吸收度，結(jié)果見Table6。Table 6 Result of recovery experiment of the method (n=5)NO. 　 a(mg) b (mg) c(mg) d (%) 　 e(%)　1 　2 3 　 　4 　5 　　a　已知樣品中總黃酮的含量　　 b 對照品的加入量 　　c　加入對照品后樣品中總黃酮的測得量　 d 加樣回收率　　e 平均加樣回收率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　由表6可知，%，表明該方法可行。9. 洋金花膠囊中間體中總黃酮的含量測定　　分別精密稱取10批洋金花膠囊中間體，甲醇溶解并定容至200ml，測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用外標(biāo)法計算洋金花有效部位中總黃酮的含量，結(jié)果見Table7。Table 7 Total flavonoids’ quantity of ten tablets halfproductionNO. weight(g) A Conc(mg/l) weight(mg) percent(%)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Weight(g)為樣品重　　weight(mg)樣品中總黃酮的重量由表7可知，%177。%。%，%,%，已達(dá)到五類新藥的標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)此，%。第二節(jié)　　有效部位中指標(biāo)性成分的含量測定1．儀器與試藥　儀器：LC?2010型HPLC儀　　　　　　 （日本島津公司） 酸度計 （上海康儀儀器有限公司） 　試藥: 甲醇（色譜純）　　　　　　　?。绹鳧IKMA公司） 對照品（自制）　　　　　　　　　　?。兌? 98%） 乙酸鈉（分析純）　　　　　?。ü枮I市新達(dá)化工廠）　　　　冰乙酸（分析純）　　　　　?。ㄌ旖蚴谢瘜W(xué)試劑六廠）2. 色譜條件：　　　流動相：甲醇：緩沖液＝2:98；色譜柱：Hypersil ODS2 5181。m 250mm 大連伊利特公司；檢測波長：268nm；柱溫：30176。C；流速：1ml/min；理論塔板數(shù)：不低于4000。　　緩沖液的制備：，加水溶解后，加冰醋酸80ml，再加水定容到1000ml，混均，微孔濾膜過濾(216。 =)即得。經(jīng)酸度計檢測，PH=。　將對照品溶液與供試品溶液在上述條件下洗脫，結(jié)果見Fig4。Fig4 HPLC Chromatogram of standard and sample solution，二者基本一致。3. 線性關(guān)系考察　　標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：，微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣量分別為5181。l, 8181。l, 11181。l, 14181。l, 17181。l, 以上述流動相進(jìn)行洗脫，記錄峰面積，測定結(jié)果見Table8。Table 8 Linear relationship of standard material　NO. 　　contents of standard materal(181。g) 　 area　 　　 1 　 474319 2 799247 3