【文章內容簡介】 液分離精子。加精液時應慢慢沿著管壁滴入，精液避免與梯度離心液混合，和梯度液之間要有明顯分層。（3） 后續(xù)步驟同雙層梯度離心法的步驟（3）（5）。（4） 去上層液體，加入適量GIVF Plus重懸沉淀，顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。 直接離心洗滌法（1） 精液標本充分液化。（2） 以1：2（精液：培養(yǎng)液）的體積比例，稀釋精液標本。（3） 把稀釋的精液標本放入離心管內，每管不超過4ml。（4） 300g，離心10分鐘。（5） 棄去上層液體。（6） 把精子混懸液分散在1ml的培養(yǎng)液中。（7） 200g，離心5分鐘。（8） 再次棄去上層液體。（9） 輕輕吹打，把精子沉淀重新懸浮在適量培養(yǎng)液中。（10） 顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。 （四）精液冷凍操作常規(guī)對于部分取精困難，或者因其他原因未能在取卵當日取得精液患者，可采取提前冷凍精液于液氮中的方法將標本保存以作為取卵日備用，以免耽誤取卵日授精時機。1. 試劑和耗材準備 QUEENS’精液冷凍保護劑復溫至室溫，精液冷凍支架，巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用；2. 步驟（1） 患者按照精液樣本的采集方法留取精液后，置37℃培養(yǎng)箱中液化。（2） 待精液充分液化后，按照WHO標準進行精液檢查，包括精液量、顏色、氣味、pH值、液化情況、精子密度、活動率、精子動力以及細胞等情況，并認真做好實驗室記錄。（3） 將精液加入試管中，按照1：1的比例緩慢加入復溫的冷凍保護劑，邊加邊混勻，充分混勻精液與冷凍保護劑。（4） 將混勻后的液體分裝至冷凍管內，在冷凍管上做好標記并將冷凍管裝上已編號的冷凍支架。（5） 將冷凍支架放置在距離液氮面15cm的液氮蒸氣中，保持10~20分鐘。（6） 將冷凍支架投入液氮，凍存。（7） 將精液冷凍患者的信息，精液分析結果，及冷凍位置及編號詳細記錄于精液冷凍登記本。（五） 精液復蘇操作常規(guī)1. 試劑和耗材準備精液處理的常規(guī)試劑盒耗材，37攝氏度水浴鍋，溫度計等2. 步驟（1） 查找需要復蘇的精液標本，從液氮罐中取出標本，核對凍存管上的信息。（2） 將精液標本放置于提前加熱的37攝氏度水浴鍋中15分鐘左右。（3） 將標本管打開，取10ml樣本涂片，生物顯微鏡觀察并記錄。（4） 根據復蘇后精子的活動力和精子密度，選擇相應的處理方法。（5） 復蘇后的精液信息需在精液冷凍登記本中進行標記，包括復蘇時間，精子的活力，密度及用途。（六）逆行射精病人的尿液處理操作常規(guī)1. 一些患者在射精過程中精子會逆行到膀胱里，從而導致了無精子癥或者沒有明顯射精現象。射精后尿液檢查中發(fā)現精子就可以確診逆行射精。當藥物治療不能達到目的時，有必要從尿液中提取精子。2. 患者在取精24小時之前服用小蘇打片。常用劑量是每天4次，每次4片（1g/片）。其作用使尿液呈堿性，精子更易存活。3. 在取卵的當天早上，患者應該在起床排空尿后，在取精的前23小時，再服用小蘇打片2片（1g/片）喝5001000ml水，如此能夠最大限度降低尿液的滲透壓。4. 標本采集和接收按照《精液標本采集與接收操作規(guī)程》執(zhí)行。5. 用手淫的方法往精液杯子內射精。6. 射精后，患者及時排尿于無菌的取精杯中，并將射出的精液和尿液同時送精液處理室。精液和尿液樣本都需要進行分析。由于尿量很多，所以需要500g離心10分鐘。7. 離心后的逆行射精樣本若有精子，按照《射出精液處理操作規(guī)程》進行。(四) PESA精子處理操作常規(guī)1. 每一患者準備洗精培養(yǎng)基 GIVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。準備90%密度梯度離心液、45%密度梯度離心液各1ml，使用前配好并在1小時內使用。2. 術前，實驗室為男醫(yī)科生準備1管預平衡的GIVF Plus和24支5ml圓底試管。3. 把巴斯德吸管在酒精燈上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用，并連同15ml錐形離心管、5ml圓底試管一起標上患者的姓名。4. 實驗室人員和臨床醫(yī)生同時核對患者姓名及其妻子姓名，在附睪、睪丸取精/活檢手術記錄上簽名。5. 附睪穿刺手術中，實驗室人員用移液器吸取少量送檢的附睪抽吸液涂于無菌Falcon3001培養(yǎng)皿，在顯微鏡下觀察是否有精子；如發(fā)現有活精子，精子數目足夠ICSI，通知男科醫(yī)生結束手術；如未見足量精子，重復上述操作。6. 反復穿刺未果，由臨床醫(yī)生決定是否改行TESA。7. 精子數目≥1106，PR精子≥15%的附睪穿刺液，可以用微量梯度離心法進行處理。8. 精子數目少的附睪穿刺液可以用直接離心洗滌法進行處理，處理好的精子在鏡下觀察并記錄，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。9. 完成相應的實驗室記錄和病歷。(五) TESA精子處理操作常規(guī)1. 術前一天準備4管GIVF Plus，每管3ml，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。2. 術前，為臨床醫(yī)生準備2個加3ml GIVF Plus 的Falcon3001皿，2個1ml的注射器。3. 實驗室人員和臨床醫(yī)生同時核對患者姓名及其妻子姓名，在附睪、睪丸取精/活檢手術記錄上簽名。4. 用無菌巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓燉，冷卻后待用，并連同15ml、5ml的圓底試管標上患者的姓名。5. 睪丸穿刺前準備一個小皿，加入2ml GIVF Plus給醫(yī)生。準備兩個1ml的注射器和兩個小皿，加入2ml的GIVF Plus。6. 臨床醫(yī)生從睪丸中抽吸出曲細精管放于盛有GIVF Plus的Falcon3001皿中，送實驗室。用平衡好的GIVF Plus至少洗滌一次后，將曲細精管移在另一有GIVF Plus的Falcon3001皿中，在體視鏡下，用兩個注射器針頭，劃開曲細精管，在倒置顯微鏡下觀察是否有精子。若精子數量能夠滿足臨床應用，通知男科醫(yī)生結束手術。7. 將有精子標本的Falcon3001皿置室溫培養(yǎng)箱孵育2h。8. 將睪丸組織混懸液轉移至離心管中，靜置2分鐘，用巴斯德吸管將大塊組織移走，300g離心5分鐘，去上清，~，混勻松蓋后置37℃、6%CO2培養(yǎng)箱，備用。9. 完成相應實驗室記錄和病歷。二、 撿卵操作常規(guī)(一) 撿卵前配液準備1. 配液在取卵前一天進行。2. 卵泡沖洗培養(yǎng)液（GMOPSTM）：取GMOPSTM10ml放入圓底試管（Falcon 2001）中，加入肝素300IU/100ml，緊蓋后置37℃培養(yǎng)箱中平衡過夜，備用。3. 撿卵皿的準備：吸取GMOPS Plus3ml培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿（Falcon 3001）內蓋礦物油2ml，每個患者準備2個，放在不通CO2氣體、37℃培養(yǎng)箱內過夜平衡。4. 洗卵液的準備：吸取3mlGIVF Plus培養(yǎng)基放入圓底試管（Falcon 2001）中，每個患者準備2管，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。5. 受精皿的準備：準備四孔板，每孔加入受精培養(yǎng)液（GIVF Plus）800ml，準備的四孔板個數依據各個患者的卵泡數估算，≤8個準備一塊四孔板，816個準備2塊四孔板，依此類推，放置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。6. 如為ICSI授精方式，準備卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus做成10個微滴，每滴25ml，每個患者準備數目參照四孔板數，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內平衡。(二) 撿卵1. 根據患者卵泡數目，在IVF工作站臺面上預熱一定數量Falcon 3003培養(yǎng)皿。2. 檢查實驗室記錄單上患者的姓名，并與患者和臨床醫(yī)生當面核對，確保無誤。3. 檢查已平衡好的培養(yǎng)液，包括沖管液，洗卵培養(yǎng)液和受精培養(yǎng)液。4. 收集在試管內的卵泡液倒入Falcon 3003培養(yǎng)皿內，形成一薄層液體，輕輕振蕩，迅速掃描卵冠丘復合物（OCCC）的存在，用巴斯德吸管吸起后在解剖顯微鏡下確認。典型的OCCC用肉眼可看到，為灰色透亮的粘液團，中央見到的小的白點為卵母細胞和放射冠，通常直徑在24mm大小。在體視鏡下（2050倍）觀察，確診粘液團內是否有卵母細胞存在，如有OCCC附于血凝塊上，可直接用巴斯德吸管分離。將選出的卵子先置于撿卵皿中暫存。5. 取出平衡好的洗卵液加入已預溫的小培養(yǎng)皿中（Falcon 3001）；更換巴氏吸管，將撿卵皿中的卵子轉入洗卵皿中洗滌2次，再轉移至受精皿中，每孔不超過3枚卵子，立即將受精皿置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在記錄表上記錄取卵情況及卵子所放置培養(yǎng)箱編號，并在培養(yǎng)箱貼上標簽。6. 為保持卵母細胞的活性，應盡可能縮短卵子暴露在培養(yǎng)箱外的時間，要求整個操作過程必須無菌、快速，并注意避光，溫度維持于37℃，以盡量減少培養(yǎng)液的pH值和滲透壓變化。7. 取卵過程如發(fā)現異常，如未見卵母細胞，獲取數明顯少于卵泡數，及時與醫(yī)生溝通。8. 撿卵結束后，粗略評估卵母細胞的質量和成熟度，確定合適的授精時間，通常需培養(yǎng)36小時。三、 體外授精操作常規(guī)（一） 體外授精1. 授精前提前30分鐘打開恒溫操作臺進行預熱，將圓底加熱試管架放置于臺面同時加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。2. hCG后3940小時，取卵后46小時進行IVF授精。