【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 上的帶型，在80100℃真空干燥24 hrs，即可固定DNA。 3. 轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）的選擇：帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度（SSC），但不能充分發(fā)揮膜潛能； NaOH，共價(jià)結(jié)合DNA是最大優(yōu)點(diǎn)。硝酸纖維膜：高鹽離子強(qiáng)度促進(jìn)DNA與膜結(jié)合（20SSC），低鹽離子強(qiáng)度導(dǎo)致小片段DNA在轉(zhuǎn)移過(guò)程中丟失，pH9，DNA不能與膜結(jié)合。4．轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer）約12 hrs取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA大小，膠厚度(5 mm)及濃度(1%)。DNA分子量大小決定時(shí)間長(zhǎng)短，部分去嘌呤減小DNA，堿轉(zhuǎn)移2hrs大部分結(jié)合到膜。DNA轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過(guò)EB染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無(wú)補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。實(shí)驗(yàn)材料及試劑：酶消化好的DNA樣品，尼龍膜， HCl， NaOH等 實(shí)驗(yàn)步驟：1． %瓊脂糖電泳制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml %瓊脂糖凝膠，采用42孔梳子（經(jīng)濟(jì)，高效）制樣，點(diǎn)樣：DNA樣品中指示劑量稍多電泳：， 使DNA遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動(dòng)1011cm (大電泳槽：40V1215hrs，小電泳槽30V45 hrs)2．轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：依膠大小每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙（11 cm），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（10），兩個(gè)玻璃盤、兩塊有機(jī)玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。3． NaOH，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋(操作示范)。4．凝膠的預(yù)處理:a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（最后一個(gè)樣品的最前端）作為電泳方向記號(hào)b) 把凝膠翻面， HCl玻璃盤中，輕輕搖動(dòng)10min，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）c) 倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠d) 倒去蒸餾水， NaOH中和e) NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）5．膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）6． NaOH，小心放置膜（ NaOH）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動(dòng)）7．膜上放2張濾紙，濾紙大小為1512cm8．放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約500g的重物，轉(zhuǎn)膜12 hrs左右 9．轉(zhuǎn)膜完畢，用2SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。用EB染膠以檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。10．用兩張濾紙包住膜，置于80100℃的真空干燥箱中，干燥24 hrs。思考：（1）為什么轉(zhuǎn)膜前要對(duì)凝膠預(yù)處理？如何處理？（2）怎樣提高轉(zhuǎn)移效率實(shí)驗(yàn)四 Southern Blotting對(duì)于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的（EB染色），因?yàn)榇笮〔坏鹊姆肿映尸F(xiàn)彌散分布，只有借助靈敏的放射性同位素（或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)），將靶DNA在凝膠上（膜上）的帶型通過(guò)特定的探針與之雜交，轉(zhuǎn)換成X光片上直觀的帶型，才能進(jìn)行相關(guān)分析。另外如果需要鑒定或?qū)ふ遗c已知DNA同源的DNA片段如：染色體步查、基因組文庫(kù)的評(píng)價(jià)和利用、陽(yáng)性克隆的分析鑒定、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分析等也都需進(jìn)行DNA的分子雜交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆胀凰氐牟僮骷胺雷o(hù)方法；掌握預(yù)雜交、探針的標(biāo)記及分子雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：依據(jù)堿基配對(duì)原則，用放射性同位素標(biāo)記的DNA探針，與固著在膜上的靶DNA雜交，經(jīng)放射自顯影，確定靶DNA的位置。1．預(yù)雜交：膜上有許多沒(méi)有結(jié)合DNA分子的地方，若不在雜交前用一些封閉劑結(jié)合位點(diǎn)，加入探針后，探針DNA分子將會(huì)結(jié)合在這些位點(diǎn)上，導(dǎo)致雜交背景深，預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點(diǎn)封閉，從而減少雜交背景。2．探針的標(biāo)記：體外標(biāo)記DNA或RNA的方法有多種，如：末端標(biāo)記，隨機(jī)引物標(biāo)記，缺刻平移（nick translation），體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcription）及各類PCR等。這些方法有的是在特定位置標(biāo)記核酸（5’或3’末端），有的標(biāo)記核酸分子內(nèi)部的多個(gè)位點(diǎn)。有的產(chǎn)物是標(biāo)記單鏈，有的產(chǎn)物是標(biāo)記雙鏈。有的方法產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的標(biāo)記產(chǎn)物，有的得到的是長(zhǎng)短不一的標(biāo)記產(chǎn)物。隨機(jī)引物標(biāo)記：在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通過(guò)與單鏈的模板配對(duì)可以啟動(dòng)DNA的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的隨機(jī)序列（如6堿基引物則有46=4096種），可以與任意模板序列相配對(duì)在許多位置形成雜交鏈，四種核苷酸底物中有一種是用同位素標(biāo)記的，因而可產(chǎn)生均勻一致高比活放射性探針。同位素標(biāo)記的探針DNA 的平均長(zhǎng)度與引物的濃度成反比， The klenow fragment去除了E．Coli DNA polymerase I 的5’→ 3’的外切酶活性，具有5’→ 3’的聚合酶活性及3’→ 5’ 外切酶活性； Primer：可通過(guò)用DNase I消化牛胸腺DNA，DNA合成儀合成或直接從公司購(gòu)買。同位素標(biāo)記的探針DNA的平均長(zhǎng)度與引物的濃度成反比 [=k/(lnPc)1/2， Pc是引物的濃度]，一般可產(chǎn)生約400600 bp的標(biāo)記產(chǎn)物。模板DNA：線狀雙連DNA。環(huán)狀DNA用限制性內(nèi)切酶切成線狀，再標(biāo)記。用純化的DNA片段作模板標(biāo)記的探針與用完整的質(zhì)粒作模板比較，可減少背景。dNTPs： 其中一種用放射性同位素標(biāo)記3．雜交： 將標(biāo)記好的探針，加到雜交液中，在一定（溫度下）條件下，使探針與膜上的DNA雜交。4．洗膜：用不同組成及離子強(qiáng)度的（嚴(yán)謹(jǐn)度）溶液，洗去膜上的封閉劑及非特異性雜交的探針實(shí)驗(yàn)材料及試劑：已轉(zhuǎn)移上DNA的尼龍膜，32P標(biāo)記的dCTP，隨機(jī)引物，20SSC，10%SDS，X光片，顯影液及定影液等實(shí)驗(yàn)步驟：1. 預(yù)雜交：將尼龍膜在2SSC中浸濕，放入雜交袋或雜交管中，加入適量雜交液（雜交液浸沒(méi)膜），趕氣泡，封口，放入65℃的雜交箱或恒溫?fù)u床中，預(yù)雜交3個(gè)小時(shí)以上，一般612hrs。2. 標(biāo)記探針：反應(yīng)體系：12blots()DNA 100ngDNTP Random primer Klenow (1u/181。l) 1181。la dCTP* add ddH2O to 按先將水和DNA ，混勻，短暫離心至管底，放至100℃干浴中變性10 min，變性探針迅速置于冰浴上5 min，按反應(yīng)體系將反應(yīng)混合液（dNTP，Random primer，Klenow ）加入變性DNA中，在同位素操作臺(tái)上，加入32P標(biāo)記的dNTP（a32P dCTP*，放射性比活3000Ci/mmol），30℃溫育3小時(shí)以上。3. 雜交將標(biāo)記好的探針，補(bǔ)加300181。l雜交液，100℃變性（or NaOH變性），加入雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上）。雜交前作標(biāo)記效率測(cè)定，25%以上可以往下做雜交， 過(guò)夜雜交。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。4. 洗膜：從低嚴(yán)謹(jǐn)度到高嚴(yán)謹(jǐn)度冼膜液（具體情況而定）：1SSC/%SDS洗膜兩次（冷5min，熱65℃，15min）174。檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度 174。SSC/%SDS 熱冼 65℃, 15min 174。SSC/%SDS or SSC/%SDS。5. 包膜：膜從洗膜液中撈出，在濾紙上晾干，膜表面無(wú)可見(jiàn)水膜為止（注意：不能太干，以防探針難以洗脫影響再次使用），用保鮮膜包膜，壓X光片，置于20或70℃ 3—7天（依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱掌握曝光時(shí)間）6. 沖洗X光片在暗室紅燈下取出X光片，置入顯影液中至雜交帶顯現(xiàn)出來(lái)（顯影時(shí)間依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱及曝光時(shí)間長(zhǎng)短可由幾秒鐘到2分鐘），轉(zhuǎn)入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（約10分鐘）。自來(lái)水沖洗干凈后，晾干，讀片。7. 膜上探針洗脫再次使用膜前，必須洗去上次探針！(1) %SDS，SSC 10min(2) ，%SDS 23min(3) ， %SDS，SSC 20min只洗去探針，而不影響膜上的靶DNA（因?yàn)镈NA與膜是共價(jià)鍵結(jié)合，而DNA與探針的結(jié)合是氫鍵結(jié)合）。附注：1. 雜交效率的影響因素a) 雜交溫度：雙鏈DNA分子，T=Tm20—25℃可達(dá)最大雜交率，DNARNA雜交分子則低于Tm 值1015℃。b) 離子強(qiáng)度()c) 雙鏈長(zhǎng)度(形成雜交物長(zhǎng)度) ：雜交率與雙鏈長(zhǎng)度成正比d) 探針的復(fù)雜程度 (重復(fù)性探針可以增加雜交率)e) 。2. 影響雜交穩(wěn)定性（影響解鏈溫度的）因素a) 離子強(qiáng)度 NaCl之間, 每173。10單價(jià)陽(yáng)離子，Tm173?！鎎) 堿基組成 ATCG（在NaCl溶液中）；c) 去穩(wěn)定劑（destabilizer） DNADNA雜交分子，每1%formamide,Tm175?！妫?M urea可降低Tm30℃d) 堿基錯(cuò)配：每 1%的錯(cuò)配可使Tm降低1℃e) 雙鏈長(zhǎng)度（探針雜交物） 500bp基本無(wú)影響3．整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：1) 保證轉(zhuǎn)膜質(zhì)量；2) 操作規(guī)范；3) 提高雜交靈敏度（信號(hào)強(qiáng)度）；a) 探針量及標(biāo)記量（探針變性）；b) 比活（性）度 =108dpm/u(108弱)；c) 靶DNA量（絕對(duì)量，酶切轉(zhuǎn)膜決定；相對(duì)量，靶DNA相對(duì)于探針過(guò)量時(shí)，完全配對(duì)雜交，探針過(guò)剩時(shí)，完全配對(duì)和非嚴(yán)格的完全配對(duì)均有發(fā)生）；d) 有惰性聚合物增加靈敏度；10%(w/v)500,000(mw)dextran sulfate或8%(w/v)PEG6000。對(duì)于單鏈探針，可以增加10fold雜交信號(hào)，dsDNA成100fold地增加雜交信號(hào)4) 提高特異性：a) 高鹽溶液促進(jìn)探針與靶序列的堿基配對(duì)20SSC 3M NaCl/ Na3Cib) 雜交后洗膜溫度T174。Tmc) 雜交后洗膜液濃度組成，高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜液使不完全配對(duì)的雜交失去穩(wěn)定，致使探針脫落d) 雜交時(shí)間8hrs 以后，DNA探針逐漸退火，少量自由與靶DNA雜交.e) 探針長(zhǎng)度（1000bp）過(guò)長(zhǎng)，高嚴(yán)謹(jǐn)度下難洗脫非完全配對(duì)雜交探針。4．放射性同位素：1) 放射性同位素發(fā)出的射線主要有：a粒子：外照射，一般能量的α粒子穿透能力較弱，射程短，危害性小，稍加防護(hù)即可（如手套）；內(nèi)照射，電離密度大，危害大。b粒子：穿透能力比α粒子強(qiáng)，外照射危害比α粒子大，可引起皮膚的放射損傷。g射線：穿透能力很強(qiáng)，外照射時(shí)危害性很大，應(yīng)采取切實(shí)有效的防護(hù)措施。2) 放射性活度及單位：放射性活度A是指一定量的放射性核素在時(shí)間間隔dt內(nèi)發(fā)生自發(fā)核衰變數(shù)dN與此時(shí)間間隔的比值。即A=dN/dt放射性活度的單位是Becquerel(貝克勒而)，簡(jiǎn)稱Bq。1Bq=1個(gè)衰變/秒；1居里=1010Bq其不表示放射出射線的多少（如60Co一個(gè)原子衰變防出1個(gè)b粒子和一個(gè)g光子，而一個(gè)32P原子只衰變出一個(gè)b粒子），也不表示射線能量的大小。3) 輻射防護(hù)的目的:防止發(fā)生對(duì)健康有害的確定性效應(yīng)(接受放射性治療的患者除外), 并將隨機(jī)性損害效應(yīng)的發(fā)生降低到被認(rèn)為可以接受的水平，從而保障放射工作人員、公眾及其后代的健康與安全，提高放射防護(hù)措施的效益，促進(jìn)放射工作的發(fā)展。4) 放射防護(hù)的原則：a) 輻射實(shí)踐的正當(dāng)化：生產(chǎn)必須，醫(yī)療必須，科研教學(xué)必須b) 輻射防護(hù)的最優(yōu)化：即綜合考慮社會(huì)、經(jīng)濟(jì)等諸因素之后，使個(gè)人劑量的大小、受照人數(shù)的多少和不確定發(fā)生的照射事件的發(fā)生概率可合理達(dá)到的低水平。c) 個(gè)人劑量限制：為了保證每個(gè)人不致受到不合理的危害，必須制定一個(gè)個(gè)人劑量限制值，放射工作人員的劑量限制：全身均勻照射的年當(dāng)量劑量限值H全身=50mSV。 不均勻照射時(shí)，有效劑量E不應(yīng)超過(guò)H全身。5) 外照射的防護(hù)措施：a) 距離防護(hù)：人體受到照射的劑量率隨著離開電離輻射源的距離的增大而減少。劑量率與距離的平方成反比。b) 時(shí)間防護(hù)：在劑量率不變時(shí)，劑量與時(shí)間成正比，即操作時(shí)間越短，人員所受到的照射劑量越小。（ 要求放射性作業(yè)應(yīng)操作熟練、操作步驟應(yīng)盡量簡(jiǎn)單易行，盡量減少在輻射場(chǎng)所逗留的時(shí)間。）c) 屏蔽防護(hù)：利用射線通過(guò)物質(zhì)時(shí)，與物質(zhì)相互作用使其能量被物質(zhì)吸收而逐漸減弱的原理，可以設(shè)置一定的屏障物來(lái)進(jìn)行防護(hù)。常用的材料有水、磚、大理石、混凝土、重金屬鉛等。d) 利用衰變：可利用放射性物質(zhì)存在自發(fā)衰變，其活性隨之減少的原理進(jìn)行外照射防護(hù)。如：半衰期小于15天的放射性廢物，允許放置10個(gè)半衰期后作一般廢物處理。6) 內(nèi)照射的防護(hù)措施防止放射性物質(zhì)經(jīng)呼吸道吸入防止放射性物質(zhì)食入防止放射性物質(zhì)經(jīng)體表進(jìn)入系列三 表達(dá)檢測(cè)在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)和基因操作的重要內(nèi)容。Northern 雜交可以測(cè)定總RNA或poly(A)+ RNA 中特定mRNA分子的大小和表達(dá)豐度，RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中電泳，按其分子的大小分開，然后將RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，經(jīng)過(guò)體外鉸鏈固定，用放射性同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針與之雜交，放射自顯影后即可以得到待測(cè)基因RNA表達(dá)水平的情況；RTPCR以mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，比Northern雜交更靈敏，對(duì)RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡(jiǎn)便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)基因時(shí)空表達(dá)的常用方法。實(shí)驗(yàn)一 RNA Extraction (mini prep)RNA的制備與分析對(duì)于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)與調(diào)控和cDNA的合成都是必須的，RNA的純度和完整性對(duì)于Northern blot，RTPCR和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。RNA分離的方法很多，其中最關(guān)鍵的因素是盡量減少RNA酶的污染方法一：氯化鋰沉淀法實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)RNA的簡(jiǎn)易制備過(guò)程，通過(guò)RNA電泳帶評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量實(shí)驗(yàn)材料：水稻幼嫩葉片實(shí)驗(yàn)原理：SDS是一種去污劑，可以抑制內(nèi)源RNA酶的活性，它不但可解聚核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合，還可與蛋