【正文】 管煅燒拉細(xì)成微吸管，一根稍粗，口徑約為200mm；另一根稍細(xì)，口徑約為140mm。卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus在Falcon 300l小皿中做10個(gè)液滴，中間兩滴用于清洗，每滴25ml，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜。8. 及時(shí)完善實(shí)驗(yàn)室記錄。6. 用移液器吸出適量精子，在遠(yuǎn)離卵子處將精子懸液加入受精皿。通常用于授精的精子終濃度為1105/ml。3. 從培養(yǎng)箱中拿出處理后孵育的精子懸液的小圓底試管，輕輕搖晃混勻，放置于圓底加熱試管架上，用移液器取10ml滴于Marker計(jì)數(shù)板，生物顯微鏡下觀察精子的濃度、活動(dòng)力。三、 體外授精操作常規(guī)（一） 體外授精1. 授精前提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)進(jìn)行預(yù)熱，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。7. 取卵過程如發(fā)現(xiàn)異常，如未見卵母細(xì)胞，獲取數(shù)明顯少于卵泡數(shù)，及時(shí)與醫(yī)生溝通。在記錄表上記錄取卵情況及卵子所放置培養(yǎng)箱編號(hào)，并在培養(yǎng)箱貼上標(biāo)簽。將選出的卵子先置于撿卵皿中暫存。典型的OCCC用肉眼可看到，為灰色透亮的粘液團(tuán)，中央見到的小的白點(diǎn)為卵母細(xì)胞和放射冠，通常直徑在24mm大小。3. 檢查已平衡好的培養(yǎng)液，包括沖管液，洗卵培養(yǎng)液和受精培養(yǎng)液。(二) 撿卵1. 根據(jù)患者卵泡數(shù)目，在IVF工作站臺(tái)面上預(yù)熱一定數(shù)量Falcon 3003培養(yǎng)皿。5. 受精皿的準(zhǔn)備：準(zhǔn)備四孔板，每孔加入受精培養(yǎng)液（GIVF Plus）800ml，準(zhǔn)備的四孔板個(gè)數(shù)依據(jù)各個(gè)患者的卵泡數(shù)估算，≤8個(gè)準(zhǔn)備一塊四孔板，816個(gè)準(zhǔn)備2塊四孔板，依此類推，放置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。3. 撿卵皿的準(zhǔn)備：吸取GMOPS Plus3ml培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿（Falcon 3001）內(nèi)蓋礦物油2ml，每個(gè)患者準(zhǔn)備2個(gè)，放在不通CO2氣體、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡。二、 撿卵操作常規(guī)(一) 撿卵前配液準(zhǔn)備1. 配液在取卵前一天進(jìn)行。8. 將睪丸組織混懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，靜置2分鐘，用巴斯德吸管將大塊組織移走，300g離心5分鐘，去上清，~，混勻松蓋后置37℃、6%CO2培養(yǎng)箱，備用。若精子數(shù)量能夠滿足臨床應(yīng)用，通知男科醫(yī)生結(jié)束手術(shù)。6. 臨床醫(yī)生從睪丸中抽吸出曲細(xì)精管放于盛有GIVF Plus的Falcon3001皿中，送實(shí)驗(yàn)室。5. 睪丸穿刺前準(zhǔn)備一個(gè)小皿，加入2ml GIVF Plus給醫(yī)生。3. 實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生同時(shí)核對(duì)患者姓名及其妻子姓名，在附睪、睪丸取精/活檢手術(shù)記錄上簽名。(五) TESA精子處理操作常規(guī)1. 術(shù)前一天準(zhǔn)備4管GIVF Plus，每管3ml，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。8. 精子數(shù)目少的附睪穿刺液可以用直接離心洗滌法進(jìn)行處理，處理好的精子在鏡下觀察并記錄，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。6. 反復(fù)穿刺未果，由臨床醫(yī)生決定是否改行TESA。4. 實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生同時(shí)核對(duì)患者姓名及其妻子姓名，在附睪、睪丸取精/活檢手術(shù)記錄上簽名。2. 術(shù)前，實(shí)驗(yàn)室為男醫(yī)科生準(zhǔn)備1管預(yù)平衡的GIVF Plus和24支5ml圓底試管。(四) PESA精子處理操作常規(guī)1. 每一患者準(zhǔn)備洗精培養(yǎng)基 GIVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。由于尿量很多，所以需要500g離心10分鐘。6. 射精后，患者及時(shí)排尿于無菌的取精杯中，并將射出的精液和尿液同時(shí)送精液處理室。4. 標(biāo)本采集和接收按照《精液標(biāo)本采集與接收操作規(guī)程》執(zhí)行。其作用使尿液呈堿性，精子更易存活。2. 患者在取精24小時(shí)之前服用小蘇打片。射精后尿液檢查中發(fā)現(xiàn)精子就可以確診逆行射精。（5） 復(fù)蘇后的精液信息需在精液冷凍登記本中進(jìn)行標(biāo)記，包括復(fù)蘇時(shí)間，精子的活力，密度及用途。（3） 將標(biāo)本管打開，取10ml樣本涂片，生物顯微鏡觀察并記錄。（五） 精液復(fù)蘇操作常規(guī)1. 試劑和耗材準(zhǔn)備精液處理的常規(guī)試劑盒耗材，37攝氏度水浴鍋，溫度計(jì)等2. 步驟（1） 查找需要復(fù)蘇的精液標(biāo)本，從液氮罐中取出標(biāo)本，核對(duì)凍存管上的信息。（6） 將冷凍支架投入液氮，凍存。（4） 將混勻后的液體分裝至冷凍管內(nèi)，在冷凍管上做好標(biāo)記并將冷凍管裝上已編號(hào)的冷凍支架。（2） 待精液充分液化后，按照WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液檢查，包括精液量、顏色、氣味、pH值、液化情況、精子密度、活動(dòng)率、精子動(dòng)力以及細(xì)胞等情況，并認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)室記錄。 （四）精液冷凍操作常規(guī)對(duì)于部分取精困難，或者因其他原因未能在取卵當(dāng)日取得精液患者，可采取提前冷凍精液于液氮中的方法將標(biāo)本保存以作為取卵日備用，以免耽誤取卵日授精時(shí)機(jī)。（9） 輕輕吹打，把精子沉淀重新懸浮在適量培養(yǎng)液中。（7） 200g，離心5分鐘。（5） 棄去上層液體。（3） 把稀釋的精液標(biāo)本放入離心管內(nèi)，每管不超過4ml。 直接離心洗滌法（1） 精液標(biāo)本充分液化。（3） 后續(xù)步驟同雙層梯度離心法的步驟（3）（5）。（2） 加入已液化好的精液，如果精液體積較多而精子數(shù)較少時(shí)再多加一管梯度離心液分離精子。 微量梯度離心法（1） 45%密度梯度離心液于15ml無菌的圓錐底試管中。（3） Plus加入5ml的圓底試管中，將精子沉淀物打散混勻后緩慢加入圓底試管的底部，松開蓋子，45度傾斜放置在試管架上，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中孵育上游30分鐘。 雙層梯度離心法+上游法（1） 雙層梯度離心法同前面的步驟（1）（5）。（7） 加入適量GIVF Plus重懸沉淀，計(jì)數(shù)精子濃度、活力等情況，并記錄。（5） 200g離心5分鐘。（3） 將已液化的精液輕輕加于梯度離心液之上，300g離心15分鐘。（1） 45%密度梯度離心液于15ml無菌的圓錐底試管中。巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用；15ml 錐形離心管（配置梯度離心液）和5ml的圓底試管（上游法）上標(biāo)上患者夫婦的姓名。3. 每一患者準(zhǔn)備洗精培養(yǎng)基GIVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。3. 精液體積采用直接測(cè)量法測(cè)量精液的體積，4. 顯微鏡鏡下精液的分析（1） 完全液化的精液，取10ul滴于Makler計(jì)數(shù)板停留1分鐘，顯微鏡評(píng)價(jià)精子的相關(guān)指標(biāo)。2. 精液外觀（1） 正常精液液化后呈均質(zhì)，灰白，精子密度非常低者可顯得透明。（3） 報(bào)告中應(yīng)注明樣本的采集是在利用避孕套通過性交法獲取的及采集地點(diǎn)（4） 一定不可以使用普通避孕套收集精液，應(yīng)為它一般含有干擾精子活力的成分（Jones 等，1986）(二) 精液標(biāo)本分析1. 精液液化（1） 精液取出后室溫液化15分鐘到30分鐘，用吸管或者在顯微鏡中觀察檢查精液是否完全液化，在家中或利用避孕套采集的樣本通常在送達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)已液化。（2） 告知患者使用避孕套方法以及如何將樣本轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)記錄樣本采集的時(shí)間，應(yīng)在采集后1小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。精液標(biāo)本不能暴露在過高或過低的溫度中，運(yùn)送途中樣本應(yīng)該保持在20℃~37℃的環(huán)境中。2. 家中精液樣本的采集（1） 對(duì)于除了在自家以外的環(huán)境下取精的確困難者，必須提出書面申請(qǐng)并簽名確認(rèn)，可以在家中進(jìn)行樣本采集。（5） 待精斑晾干后編號(hào)保存兩年，在精液處理記錄本上記錄患者信息，編號(hào)和保存位置。（3） 護(hù)士核對(duì)患者夫婦姓名、有效證件后，在取精杯杯身及杯蓋上標(biāo)記患者夫婦姓名及病歷號(hào)。第三節(jié) 胚胎實(shí)驗(yàn)室操作常規(guī)一、 精液處理操作常規(guī)(一) 精液樣本采集1. 射出精液標(biāo)本的采集（1） 給患者一個(gè)明確的書面或口頭有關(guān)精液采集的指導(dǎo)說明，標(biāo)本采集時(shí)間應(yīng)為禁欲至少兩天，最長(zhǎng)不超過七天。練習(xí)ICSI 精子制動(dòng)、吸打、定點(diǎn)停位，模擬卵子注射。3. 理論學(xué)習(xí)：衛(wèi)生部【176】號(hào)文件，人類輔助生殖倫理原則，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控，基礎(chǔ)內(nèi)分泌、遺傳學(xué)理論，人類卵子、精子發(fā)生生理，精子獲能，IVF、ICSI適應(yīng)癥，卵子形態(tài)與成熟度，胚胎序貫培養(yǎng)系統(tǒng)，精子、胚胎凍融原理，ICSI安全性等。四、 實(shí)驗(yàn)室新人培訓(xùn)計(jì)劃1. 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須具備醫(yī)學(xué)或生物學(xué)專業(yè)本科以上學(xué)歷，并掌握系統(tǒng)的臨床胚胎學(xué)知識(shí)和細(xì)胞培養(yǎng)技能。(三) 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境按常規(guī)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，溫度由層流空調(diào)機(jī)組調(diào)控，發(fā)生故障立即報(bào)修；若空氣細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果超標(biāo)，立即清潔實(shí)驗(yàn)室，并重新進(jìn)行空氣培養(yǎng)。常備至少一瓶CO2。對(duì)現(xiàn)用液氮罐進(jìn)行定期檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)異常泄漏，立即轉(zhuǎn)移故障罐內(nèi)的胚胎或精子。其它故障立即報(bào)修。2. 熱臺(tái)：定期檢測(cè)，一旦出現(xiàn)故障，立即報(bào)修。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的主要設(shè)備，如顯微鏡、培養(yǎng)箱、冰箱等均連接UPS，保證電壓穩(wěn)定，并且在意外斷電情況下可提供6－8小時(shí)的電力供應(yīng)。(十四) 中心常用試劑、耗材一覽表本生殖醫(yī)學(xué)科目前鼠胚實(shí)驗(yàn)常規(guī)使用Vitrolife G5系列培養(yǎng)基。對(duì)于受主觀因素影響較大項(xiàng)目，應(yīng)該進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量控制檢查，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的操作的準(zhǔn)確性和精確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)室管理人員必須按實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保障體系執(zhí)行，明確實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)格遵循質(zhì)量安全程序、標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法。如沒有達(dá)到上述正常標(biāo)準(zhǔn)，須查找原因，及時(shí)改正。(十二) 實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)指標(biāo)的定期回顧總結(jié)每月統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)室的各種數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析和檢查。如果小于85%，應(yīng)考慮可能有細(xì)胞毒素