【文章內(nèi)容簡介】 維生素P樣作用、抗病毒作用、抑制醛糖還原酶作用等。由于蘆丁屬于維生素類藥，有降低毛細血管通透性和脆性的作用，保持及恢復毛細血管的正常彈性。蘆丁的化學結構式(如圖11)。圖 11 蘆丁的結構式圖 高效液相色譜的介紹高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)又稱“高壓液相色譜” 、 “高速液相色譜” 、 “高分離度液相色譜” 、 “近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將 師范學院 2022 屆本科畢業(yè)論文 3具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點： (1) 高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。 (2) 高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 (3) 高靈敏度：紫外檢測器可達 ng，進樣量在 μL 數(shù)量級。 (4) 應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。 (5) 分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在 15～30min，有些樣品甚至在 5min 內(nèi)即可完成，一般小于 1 小時。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應” 。該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。目前國內(nèi)對連翹及桑葚中蘆丁含量測定主要有比色法、紫外分光光度法和HPLC 及 GC 法等，但比色法的干擾因素較多，而紫外分光光度法準確度不高，因此本實驗采用高效液相色譜法測定連翹及桑葚中蘆丁的含量。2 實驗部分 儀器與試劑島津LC?20AT高效液相色譜系統(tǒng)(LC?6AD輸液泵，SPDM20A二極管陣列檢測器，CLASS?， CTO?6A柱溫箱)；1012A型數(shù)顯恒溫干燥箱；AY120電子天平(SHIMADZU)；SZ93型自動雙重純水蒸餾器； 師范學院 2022 屆本科畢業(yè)論文 4AUW220D 十萬分之一天平(SHIMADZU，Japan )25 mL 比色管25 mL 容量瓶蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所提供)連翹(安徽省亳州市科輝藥業(yè)有限責任公司)桑葚(四川祥龍綠色有限公司)甲醇(色譜醇.，成都科龍化工試劑廠)磷酸(.，成都科龍化工試劑廠)除甲醇外，其余試劑均為分析醇實驗用水為二次重蒸水 儀器工作條件SHIMDZU VPODS 反相色譜柱(150 mm mm， μm)；流動相為V(% )：V(硫酸溶液)為(6:4)混合溶液，流量為 mLmol1，紫外檢測波長為 360 nm，進樣量為 5 mL，柱溫為 35 ℃。以蘆丁峰計理論塔板數(shù)大于3500。 樣品制備 標準儲備液的制備精密稱量經(jīng)五氧化二磷干燥的蘆丁對照品 mg，置 25 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，超聲，再精密吸取 1 mL 稀釋十倍，配制成濃度為232μg mL 1 的蘆丁標準儲備液。 供品溶液的制備將待測樣品連翹于 75℃干燥至恒重，粉碎過 mm 篩，精密稱定約 g，置于 25 mL 錐形瓶中，加入甲醇 15 mL，避光超聲處理 40 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL 容量瓶。分別用 5 mL 甲醇重復提取 2 次，合并提取液，甲醇定容至 25 mL，搖勻，微孔針頭過濾器過濾，待測。將待測樣品桑葚于 75℃干燥至恒重，粉碎過 mm 篩，精密稱定約 g，置于 25 mL 錐形瓶中，加入甲醇 15 mL，避光超聲處理 40 min，上清液轉(zhuǎn)入 師范學院 2022 屆本科畢業(yè)論文 525 mL 容量瓶。分別用 5 mL 甲醇重復提取 2 次，合并提取液，甲醇定容至 25 mL，搖勻，微孔針頭過濾器過濾，待測。 高效液相色譜法測量 流動相的準備(1) 根據(jù)實驗選擇合適的流動相，配制流動相溶液，并根據(jù)需要選擇不同的濾膜( μm )進行過濾。(2) 將抽濾后的流動相進行超聲脫氣處理 20 min。 島津 LC?20AT 高效液相色譜系統(tǒng)的操作(1) 打開 HPLC 工作站，連接流動相管道和檢測系統(tǒng)。(2) 進入 HPLC 控制界面的主菜單，點擊 manual，進入手動菜單。(3) 若系統(tǒng)有一段時間未用，或換了新流動相，需先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵直 接在泵的出水口用針頭抽取。沖洗進樣閥，需在 manual 菜單下，點擊purge 再點擊 start，沖洗速度不要超過 10 mlmin1。(4) 調(diào)節(jié)流量，初次使用新流動相，可先試一下壓力，流速越大壓力越大，通常不要超過 2022。點擊 injure，選擇合適的流速，點擊 on，開始走基線，當基線平穩(wěn)，開始進樣準備。(5) 設計測試方法： (a)點擊 file，選擇 select users and methods，即可選取各種現(xiàn)有的測試方法。(b)若需建立新的方法，點擊 new method，設置新的測試方法，保存文件。(c)根據(jù)需要選擇配件，包括進樣閥，泵，檢測器等。確定后，點擊protocol。(d)一個完整的測試方法包括：進樣前的穩(wěn)流，一般 25 min；基線歸零；進樣閥的 loadinginject 轉(zhuǎn)換；測試時間，隨樣品的不同而不同。 師范學院 2022 屆本科畢業(yè)論文 6(e)測試完畢，導出數(shù)據(jù)，存盤。(6) 關機操作(a)全部測定完畢后，按規(guī)定用適當溶劑(一般用甲醇)沖洗泵，進樣器、柱及檢測器。(b)關閉電源，使用登記。3 結果與討論 檢測波長的選擇蘆丁對照品與供試品在本實驗溶劑體系下，用二極管陣列檢測技術 [12,13]對組分峰進行全波段紫外光譜掃描。(圖31)。Spectrum at time min.nm200 400 600 800mAU0100200mAU0100200 min圖 31 蘆丁對照品紫外光譜圖蘆丁與樣品相同保留值處組分峰紫外光譜具有良好一致性。蘆丁最大吸收波長分別為 205 nm、258 nm、360 nm。在 205 nm 處供試品中的其它不明物組分有一定吸收，將對測定產(chǎn)生干擾，導致測定誤差，在 258 nm、360 nm 處雖無其它組分干擾吸收，但在 360 nm 處的吸收更強。而 360 nm 波長處待測組分與其他雜質(zhì)峰能夠基線分離，檢測靈敏度高，故本實驗確定最佳檢測波長為 360 師范學院 2022 屆本科畢業(yè)論文 7nm。 流動相的優(yōu)化由于黃酮類化合物常帶有酚羥基，在水中會部分解離，而未解離的羥基與固定相作用較強，從而導致拖尾，所以黃酮類的反相 HPLC 中需要加入酸調(diào)節(jié)p