【文章內(nèi)容簡介】 則因其結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)接近，用電位滴定法進(jìn)行分析分離具有一點的難度，可根據(jù)實際要求選擇使用HPLC等方法進(jìn)行檢測。　　此外，一般而言極性氨基酸在水中的溶解度大于非極性氨基酸，因而更有利于實驗操作?！　、瓢被岬臓I養(yǎng)學(xué)分類　　氨基酸在營養(yǎng)學(xué)上可分為必需氨基酸和非必需氨基酸?！　”匦璋被嵊校嘿嚢彼?、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和苯丙氨酸八種。對于嬰兒來說，組氨酸也是必需氨基酸?！　《^非必需氨基酸并非是人體不需要的氨基酸，只是這些氨基酸可以通過人體自身合成或由其他氨基酸轉(zhuǎn)化而成，并非以食物為惟一的獲取途徑。這類氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸等[28]?！　∫罁?jù)氨基酸的極性分類和營養(yǎng)學(xué)分類，結(jié)合其不同的生理功能和藥理作用，可使研究者在所測定氨基酸的選擇上有較強的針對性，因而對于混合氨基酸含量測定的研究有相當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)意義?！　　“被岬乃幚韺W(xué)作用　　在20種氨基酸中，8種必需氨基酸是人體內(nèi)無法合成的，必須依靠外源供給。此外，精氨酸和組氨酸人體雖然也能合成，但是由于存量不足，若長期得不到補充也將導(dǎo)致負(fù)氮平衡。而與脂類和糖類相比，非必須氨基酸在體內(nèi)的儲存量也較低，因此，氨基酸的損耗偏多或供應(yīng)不足均易引發(fā)各類臨床癥狀，必須進(jìn)行及時的補充?！　〕?0種基本氨基酸外，另有7080種非蛋白質(zhì)氨基酸也已經(jīng)作為藥物被開發(fā)和應(yīng)用。本文僅對20種基本氨基酸的藥理作用作簡單介紹?！　、虐被嶙鳛闋I養(yǎng)劑的應(yīng)用　　營養(yǎng)劑是氨基酸類物質(zhì)作為藥物的主要應(yīng)用形式。作為機體合成蛋白質(zhì)和其他含氮生物分子的原料，氨基酸制劑被廣泛地應(yīng)用于手術(shù)前后、創(chuàng)傷、燒傷或其他原因造成的營養(yǎng)不良和氮平衡失調(diào)等情況?！　∮捎诓煌瑐τ诎被岬男枨蠛屠媚芰Σ煌?，因而針對不同的病癥和病人有各種不同的營養(yǎng)型復(fù)合氨基酸制劑?！　、瓢被嵩谛哪X血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的藥理學(xué)作用　　支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）可提高心肌功能，改善人體運動能力；L苯丙氨酸可以治療高血壓；興奮性氨基酸即天冬氨酸、谷氨酸具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的興奮作用；色氨酸具有催眠作用：絲氨酸具有治療精神分裂癥的作用?！　、前被岬目鼓[瘤作用　　高濃度的氨基酸（5mol/L），如精氨酸、酪氨酸和色氨酸，對肝癌和肺癌細(xì)胞有抑制作用；動物飼料中增加10%的精氨酸可以有效地抑制二甲苯胺的化學(xué)致癌作用?！　、劝被嵩谔悄虿∪酥械膽?yīng)用　　除了含硫氨基酸和芳香組氨基酸外的其他氨基酸在體內(nèi)脫氨生成酮酸，參與碳水化合物的代謝及糖的異生作用，可以減少胰島素的需要量[29] [30]?！　　“被崴幬锏姆诸悺　「鶕?jù)《中國藥典》的記錄，筆者對于目前主要的氨基酸類藥物進(jìn)行了如下分類：　　。通常作為缺少某種特定氨基酸所導(dǎo)致的病癥的治療藥物，如谷氨酸、精氨酸等?！　　３?AA（主要成分為三種支鏈氨基酸）外，一般含10種以上氨基酸（通常8種人體必需氨基酸是必備的），主要作為營養(yǎng)液，可用于腎病、胃病等的治療?！　?。通常為一種或少量種類氨基酸與維生素、葡萄糖、無機鹽或其他藥理物質(zhì)所組成的復(fù)合藥物?！　〗Y(jié)合電位滴定法的特點，用檢測方法對第三類藥物進(jìn)行含量分析存在理論上的可能性，同時也具有廉價、便捷和精確度較高等優(yōu)勢?！　　“被岱治黾夹g(shù)　?、虐被岱治黾夹g(shù)概述　　氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成部分，而蛋白質(zhì)又是生物體的主要組成物質(zhì)，因而可以說氨基酸分析是生命科學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一?！　“被岱治黾夹g(shù)始于上世紀(jì)三、四十年代，當(dāng)時使用的方法包括色譜、離子交換樹脂等。而在20世紀(jì)80年代之后，隨著毛細(xì)管電泳與電化學(xué)方法測定相結(jié)合之后，電導(dǎo)檢測、安培檢測和電化學(xué)發(fā)光分析等檢測技術(shù)成為了氨基酸分析的另一種發(fā)展趨勢?！　、瓢被岱治黾夹g(shù)的分類　　氨基酸分析，按分離方法可分為紙色譜法、離子交換法、反相高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法等；按檢測分析方法可分為化學(xué)分析法、電化學(xué)分析法（包括電導(dǎo)檢測、安培檢測）、分光光度法（包括可見分光光度法、紫外分光光度法和熒光分光光度法）等；按衍生反應(yīng)的先后，可分為柱前衍生和柱后衍生法[29]?！　∧壳爸饕被岱治黾夹g(shù)的比較和特點可見表12。表12　主要氨基酸分析技術(shù)的比較[30] [32]類別分析方法測定原理及測定對象特點化學(xué)分析法甲醛滴定法在中性或弱堿性水溶液中，α氨基酸與甲醛反應(yīng)生成亞甲基氨基衍生物，亞甲基衍生物用堿滴定，從而得到樣品中總氨基酸的含量。簡單易行、快速方便。準(zhǔn)確度差，終點較難以掌握。凱氏定氮法測定樣品中氮的總含量，然后根據(jù)蛋白質(zhì)和氨基酸中的氮含量，獲知含氮氨基酸、蛋白質(zhì)的總量。準(zhǔn)確度較高。操作步驟復(fù)雜，試劑消耗量多，測定周期長。電化學(xué)分析法電導(dǎo)檢測法、安培檢測法等對于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等電活性的氨基酸，可直接測定每組分氨基酸的含量。無電活性的氨基酸，應(yīng)通過衍生化反應(yīng)對其進(jìn)行測定。簡單靈敏、無污染，與各類現(xiàn)代化的分離方法相結(jié)合可簡化操作過程，節(jié)約分析時間?？赡嫘暂^差、背景干擾大、有直接電化學(xué)活性的氨基酸較少，大部分氨基酸仍需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)。分光光度法可見／紫外／熒光分光光度法通過使氨基酸分子中的氨基、羧基或其他活性基團與衍生劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成具有可見光、紫外生色團或能產(chǎn)生熒光的衍生反應(yīng)產(chǎn)物，并以相關(guān)檢測儀器測定單組分氨基酸的含量。不同的衍生試劑各有不同的優(yōu)劣之處。一般而言，該方法可能存在衍生時間長、衍生產(chǎn)物組分復(fù)雜、穩(wěn)定性差、對某些特定基團無化學(xué)活性等不足，但通過選擇適當(dāng)?shù)难苌噭┗究梢越鉀Q這些問題，同時該方法對于氨基酸成分的測定精確度也較高。色譜分析法紙色譜法采用不同的層析液和檢測用顯色劑，可對30多中氨基酸及其衍生物進(jìn)行分析操作簡單、分析效能較高、所需儀器設(shè)備廉價。薄層色譜法常用硅膠等薄層板及相應(yīng)的展開劑對氨基酸進(jìn)行分離，然后分開采用紫外、熒光或可見光光度法進(jìn)行檢測?？蓪?0多中氨基酸及其衍生物進(jìn)行分離。展開快、分離效能高、靈敏度高、耐腐蝕。氣相色譜法將所分析的氨基酸衍生為易于氣化的物質(zhì)，可測定多組分的混合氨基酸。高效能、選擇性好、靈敏度高、操作簡單，且成本較低。同時可與質(zhì)譜聯(lián)用，確定氨基酸的結(jié)構(gòu)，從而有可能發(fā)現(xiàn)新的氨基酸或分析非蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)。高效液相色譜分析法柱后衍生高效陽離子交換色譜法利用氨基酸在酸性條件下形成陽離子的性質(zhì)，在陽離子交換柱中對其進(jìn)行分離，將分離后的氨基酸與茚三酮或其他柱后衍生劑作用，產(chǎn)生在紫外可見光區(qū)域內(nèi)有吸收的物質(zhì)，并用紫外可見光度檢測器進(jìn)行定量分析。準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，能測定大量氨基酸及其同系物。靈敏度不高，并且需要雙波長檢測。柱前衍生反向高效液相色譜法通過和能與氨基酸定量反應(yīng)的衍生劑作用，形成具有一定穩(wěn)定性并且適用于反相色譜分離的衍生物，并經(jīng)高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。較之柱后衍生法更加靈敏快速，且分辨率高、檢測靈敏度高、分析時間短，操作自動化。毛細(xì)管電泳法多用于手性氨基酸的分析分離。溶劑消耗少、分析速度快、絕對靈敏度高。重現(xiàn)性較差?！　∮捎诳茖W(xué)研究、疾病診斷、質(zhì)量檢測、產(chǎn)品開發(fā)等方面對于氨基酸含量分析有著廣泛的需求，同時基于以上相對成熟的氨基酸分析分離技術(shù)，相關(guān)的氨基酸分析儀器應(yīng)運而生?！　“被岱治鰞x的主要是依據(jù)高效液相色譜技術(shù)研制開發(fā)的。自1958年首臺氨基酸分析儀誕生起，傳統(tǒng)的氨基酸分析儀器采用的均為柱后衍生高效陽離子交換色譜（HPCEC）法。而在上世紀(jì)70年代末，根據(jù)柱前衍生反向高效液相色譜法（RPHPLC）開發(fā)的新型氨基酸分析儀粉墨登場，并逐步占據(jù)了氨基酸分析儀市場的主導(dǎo)地位。[33]　　與此同時，一些最新的尖端分析技術(shù)，如等溫滴定反應(yīng)熱測定儀（ITC）、核磁共振（NMR）引導(dǎo)下的滴定分析等方法，也已經(jīng)能夠逐步被應(yīng)用于氨基酸的分析分離。[34] [39]　　但另一方面，如何通過簡單、廉價而又具有較高準(zhǔn)確性的儀器或?qū)嶒灧椒▽Π被岬暮窟M(jìn)行測定，始終是氨基酸分析技術(shù)中一個不可忽視的發(fā)展方向?！　τ诎被岱治鲋幸恍┖唵蔚臏y定任務(wù)，如總酸度和氨基酸態(tài)氮的總量等的分析，完全可以通過自動電位滴定儀完成測定，并保障較高的準(zhǔn)確度。此外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的記載，也曾有研究者使用自動滴定儀對單組分氨基酸進(jìn)行過測定，同樣取得了良好的效果[40][50]?！”疚乃鞯墓ぷ鳌　”疚牟捎萌鹗咳f通公司的798 MPT型全自動滴定儀作為主要分析儀器，以氫離子選擇性電極為工作電極，以氫氧化鈉為滴定劑，通過恒電位滴定法分別測定單組分谷氨酸、絲氨酸、組氨酸溶液及其兩組分混合溶液的含量，所得數(shù)據(jù)用MATLAB軟件進(jìn)行處理，并對實驗誤差進(jìn)行討論和分析。2　實驗原理　計算模型　　本實驗的主要原理為恒電位滴定分析法，其數(shù)學(xué)模型的一般表達(dá)式為：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　其中，i和j分別對應(yīng)不同的工作電位和混合溶液中的不同組分，m為組分個數(shù)。根據(jù)本實驗的測定對象，在進(jìn)行單組分測定時，恒電位滴定法的一般數(shù)學(xué)模型在每一個工作電位均可表示為：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ⑵其中，Vi為達(dá)到工作電位時消耗的滴定劑體積；c為該氨基酸的物質(zhì)的量濃度； k項均為常數(shù)?！　∪暨M(jìn)行多組分測定，則均可依據(jù)⑴式，得到與之形式相類似的計算模型。　測定步驟　　　平衡時間測定（MEAS）　　平衡時間測定模式下，在所測定的氨基酸溶液中一次性加入一定量的氫氧化鈉滴定劑，觀察滴定曲線，并確定等體積和恒電位測定時的反應(yīng)時間設(shè)置。　　　等體積測定（MET）　　等體積測定模式下，在所測定的氨基酸溶液中分批加入一定量的氫氧化鈉滴定劑，觀察滴定曲線，并確定進(jìn)行恒電位測定時的工作電位?！　　『汶娢粶y定（DET）　　配制若干濃度配比不同的待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在得到相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)后，通過MATLAB編程進(jìn)行解析，求出每個工作電位下的各項k值。然后使用恒電位滴定法測定各待測溶液，從而求出其中各組分氨基酸的含量?！y定對象　　本實驗測定的三種α氨基酸均為基本氨基酸，其結(jié)構(gòu)分別為：　圖21　組氨酸結(jié)構(gòu)式　　　　圖22　谷氨酸結(jié)構(gòu)式　　　　圖23　絲氨酸結(jié)構(gòu)式　　表21為三種氨基酸的pK值、溶解度等相關(guān)物理性質(zhì)。表21　組氨酸、谷氨酸、絲氨酸的pK值和溶解度比較氨基酸縮寫符號pKCOOHpKNH2pKRpI溶解度(g/100ml)組氨酸His谷氨酸Glu絲氨酸Ser25　電極的選擇　　本實驗選用氫離子選擇性復(fù)合電極作為工作電極?！　潆x子選擇性電極內(nèi)盛放著一定濃度HCl溶液（內(nèi)參比溶液），插入銀—氯化銀電絲（內(nèi)參比電極），電極玻璃泡下端是一層特素的玻璃膜（電極膜）。玻璃膜中的Na+與溶液中的H+可發(fā)生交換，對H+有選擇性響應(yīng)?！　潆x子選擇性電極插入含H+的試液，該電極可記作：Ag,AgCl(s)｜HCl溶液｜玻璃膜｜試液（αH+）3　實驗部分　實驗儀器及試劑　　　實驗儀器　　798MPT全自動滴定儀（瑞士萬通）　　氫離子選擇性復(fù)合電極（瑞士萬通）　　電子天平　　計算機　　移液槍（DragonMed　0～）　　實驗室常用玻璃儀器　　　實驗試劑　　谷氨酸固體 生化試劑　　絲氨酸固體 生化試劑　　組氨酸固體 生化試劑　　氫氧化鈉固體 AR　　鹽酸 AR　　硝酸鈉固體 AR　溶液的配制　　　　　，加入蒸餾水使其逐漸溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移到4L的塑料容器中，潤洗燒杯數(shù)次，最終用蒸餾水定容至4L。，作為滴定劑?！　　?02 mol/L絲氨酸溶液的配制　　，加入蒸餾水使其逐漸溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，潤洗燒杯數(shù)次，容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。102 mol/L的絲氨酸溶液。以此溶液作為絲氨酸溶液的母液，根據(jù)需要再配制成其它濃度的絲氨酸溶液。　　　102 mol/L組氨酸溶液的配制　　，加入蒸餾水使其逐漸溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，潤洗燒杯數(shù)次，容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。102 mol/L的組氨酸溶液。以此溶液作為組氨酸溶液的母液，根據(jù)需要再配制成其它濃度的組氨酸溶液?！　　?02 mol/L谷氨酸溶液的配制　　，加入蒸餾水使其逐漸溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，潤洗燒杯數(shù)次，容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。102 mol/L的谷氨酸溶液。以此溶液作為谷氨酸溶液的母液，根據(jù)需要再配制成其它濃度的谷氨酸溶液?！　　?mol/L硝酸鈉溶液的配制　　用托盤天平稱取89g硝酸鈉固體至100mL燒杯中，加入蒸餾水使其逐漸溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移到1L的試劑瓶中，潤洗燒杯數(shù)次，最終用蒸餾水定容至1L。，作為離子強度調(diào)節(jié)劑?！　　　　∮昧客卜Q取2mL濃度為37%的鹽酸，轉(zhuǎn)移至1L的容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至1L。，可用于調(diào)節(jié)氨基酸溶液的酸度?！　　谓M分氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液的配制　　分別配制三種單組分氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液。103 mol/L，103 mol/L，