【文章內(nèi)容簡介】 廠7超凈工作臺SWCJ1BU型蘇凈集團安泰公司8電熱恒溫孤峰干燥箱DHG9240A型上海精宏實驗設備有限公司9顯微鏡XSZG型上海精宏實驗設備有限公司10空氣浴振蕩器HZQC型哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠 主要試劑、藥品和培養(yǎng)基表2 實驗藥品編號品名規(guī)格生產(chǎn)廠家1AEO7分析純國藥集團化學試劑有限公司2牛肉膏生化試劑國藥集團化學試劑有限公司3蛋白胨生化試劑國藥集團化學試劑有限公司4葡萄糖生化試劑國藥集團化學試劑有限公司5瓊脂粉生化試劑國藥集團化學試劑有限公司6氯化鈉分析純國藥集團化學試劑有限公司7酵母膏生化試劑國藥集團化學試劑有限公司8氫氧化鈉分析純國藥集團化學試劑有限公司9鹽酸分析純國藥集團化學試劑有限公司10MgSO47H2O分析純上海金山區(qū)興塔美興化工廠11K2HPO4分析純國藥集團化學試劑有限公司12KCl分析純國藥集團化學試劑有限公司13FeSO47H2O分析純國藥集團化學試劑有限公司14NH4Cl分析純國藥集團化學試劑有限公司15溴麝香草酚藍分析純國藥集團化學試劑有限公司表2 實驗藥品（續(xù)）編號品名規(guī)格生產(chǎn)廠家16NH4H2PO4分析純國藥集團化學試劑有限公司17檸檬酸三鈉分析純國藥集團化學試劑有限公司18胱氨酸分析純國藥集團化學試劑有限公司19Na2SO4分析純國藥集團化學試劑有限公司20過氧化氫分析純國藥集團化學試劑有限公司21KI分析純國藥集團化學試劑有限公司22乙醇分析純國藥集團化學試劑有限公司23甲基紅分析純國藥集團化學試劑有限公司24亞甲基藍分析純國藥集團化學試劑有限公司25碘分析純國藥集團化學試劑有限公司26KOH分析純國藥集團化學試劑有限公司27精密pH試紙（）28醋酸鉛試紙 培養(yǎng)基（1）LB富集培養(yǎng)基蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水 1000mL。（2）無機鹽基礎篩選培養(yǎng)基NH4Cl , MgS04 . 7H2O g， g，K2HPO4 g， KCl g，酵母膏 g， AEO7 g（ g），蒸餾水 1000mL。（3）固體培養(yǎng)基%的瓊脂。（4）休和利夫培養(yǎng)基葡萄糖10 g，蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 g，水洗瓊脂 5 g左右，溴麝香草酚藍 g，蒸餾水 1000mL。（5）胰蛋白胨培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸餾水 1000mL。（6）葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基葡萄糖 5g，蛋白胨 5g，K2HPO4(或NaCl) 5g，蒸餾水 1000mL。（7）西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基NaCl 5 g，MgSO47H2O g，NH4H2PO4 1 g，K2HPO4 。3H2O 1 g，檸檬酸三鈉 2 g，蒸餾水 1000mL。（8）蛋白胨胱氨酸培養(yǎng)基[18]蛋白胨 10 g， 胱氨酸 g，Na2SO4 g， 蒸餾水 1000mL。 降解脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）的菌種的分離篩選從清潭污水處理廠取活性污泥標號①。再分別從菜園和梨園土壤中采集地表層以下15cm深處的土樣，分別標號為②、③。 制備土壤懸液取每份樣品1克分別加入3個搖瓶內(nèi)，加入49mL生理鹽水（%NaCl），放入搖床震蕩20分鐘，使土樣充分打散，即成為102的土壤懸液。 菌種的富集原理：富集培養(yǎng)是微生物學家最強有力的手段之一主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制訂特定的環(huán)境條件，使在該條件下只有目標微生物生長旺盛，從而使其在群落中數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需的微生物的特點從物理、化學、生物及綜合多個方面進行選擇，如溫度、pH、光照、氧氣、營養(yǎng)等。根據(jù)以上原理，并結合本實驗特點，我采用含有AEO7的LB液體培養(yǎng)基作為富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基。方法：將土壤懸液靜止20~30分鐘，吸上清1mL加入到含1‰AEO7 的LB液體培養(yǎng)基中（不需滅菌），放在空氣震蕩器中30℃恒溫培養(yǎng)16~24小時。再取培養(yǎng)液1mL加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)，重復三次。 菌種篩選初篩：吸取富集培養(yǎng)液1ml，加入到已滅菌的含有1‰ ‰酵母膏無機鹽基礎培養(yǎng)基，30℃恒溫搖床培養(yǎng)4~5天后。復篩：再取初篩培養(yǎng)液1mL，加入到新鮮的含有2‰ AEO7但不加酵母膏的無機鹽基礎培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)。如此從AEO7濃度2‰重復到5‰ 。進入到菌種分離純化階段。 菌種分離純化取AEO7濃度為5‰的細菌培養(yǎng)液1mL，進行梯度濃度稀釋到108。分別取各梯度濃度的稀釋液500μL涂布在含5‰AEO7的無機鹽固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，長出單菌落。劃線分離：用接種環(huán)，挑取長出的單菌落，在含5‰AEO7的無機鹽固體培養(yǎng)基上劃線分離，30℃培養(yǎng)3天，長出單菌落。純化：挑取劃線分離單菌落，繼續(xù)劃線分離，30℃培養(yǎng)，長出單菌落后，用單染色法檢驗細菌是否為純種菌，如果不是，繼續(xù)挑取單菌落劃線分離，直到檢驗為單菌落為止。（5）純種檢驗 ：光學顯微鏡觀察（單染色）① 涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種平皿中挑出少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1~。② 干燥 將圖片放在室溫下自然干燥。③ 固定 手扶載玻片一段，使涂菌的一面向上，將載玻片通過微火2~3次，在火上固定時，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載玻片在火上烤，否則菌體形態(tài)會毀壞。④ 染色 將涂片至于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2分鐘。⑤ 水洗 傾去染色液，斜置載玻片，用自來水的細水流由載玻片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載玻片上流下的水中無染色液的顏色為止。⑥ 干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕的吸干，注意不要擦掉菌體。⑦ 鏡檢 待標本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，滴一滴香柏油在涂有菌體的部位，再用油鏡觀察。由菌株分離實驗結果可以看出，純種分離得到的菌株量較大，如果對每一菌株都作全面或精確地性能測定，工作量是很大的，而且也沒必要。因此用在篩選培養(yǎng)基上點種的方法，通過長出的菌苔的時間的長短以及大小，以及對篩得的純種菌進行進一步的篩選，最后選出8個菌株進入到下面的降解性能測定階段，這樣就大大縮短了實驗時間，提高了篩選效率[19,20]。 AEO7濃度的測定—KII2法分光光度法 AEO濃度測定原理碘作為一種電子受體能與聚氧乙烯型非離子表面活性劑反應形成絡合物。Ross和Becher、等利用碘的這一性質(zhì)測定聚氧乙烯型非離子表面活性劑的臨界膠束濃度，認為碘與表面活性劑的相互反應是基于碘與表面活性劑中氧原子的誘導作用導致了電荷轉(zhuǎn)移形成絡合物。基于以上原理，本實驗以KII2溶液為顯色劑掃描顯色溶液體系的可見光光譜，確定其特征吸收波長，于特征吸收波長下測定聚氧乙烯型非離子表面活性劑濃度。 特征吸收波長的測定準確稱取1g I2和2g KI,加蒸餾水溶解，定容至100mL作為KII2顯色劑。因形成I3不太穩(wěn)定，顯色劑應避光保存。于10ml試管中加入10ml一定濃度的AEO7溶液，搖勻靜置120min。然后以蒸餾水為參比用全光分光光度計進行全光掃描，檢測出最大吸收波長[17]。 AEO7濃度標準曲線的繪制操作步驟：① AEO7加入100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL。② 取10支干凈的試管，分別編號為1~10號，用移液器向編號為1~9分別移取200μL、400μL、600μL、800取兩毫升上清液加入到10mL試管中，再分別向試管中加入8mL蒸餾水，μL、1200μL、1400μL、1600μL 、1800μL。10號試管不加標準液。③ 向試管里補蒸餾水至10mL。%的KII2。顯色120min。④ 分光光度計480nm波長，以蒸餾水作參比，測定吸光值。 篩選菌種降解性能的測定（1）前期培養(yǎng)在編號為1~9的100ml的搖瓶里裝入30ml含5‰AEO7的無機鹽基礎液體培養(yǎng)基。滅菌后接入此前篩到得8株菌，9號瓶不接菌。包扎好，30℃，130rp,搖床培養(yǎng)108h后測定降解效率。（2）降解率的測定① 經(jīng)過108小時的培養(yǎng)，分別用移液器取培養(yǎng)液5mL到5mL的離心管中，在8000rpm離心10分鐘。② 取兩毫升上清液加入到10mL試管中，再分別向