【文章內(nèi)容簡介】 解后， mL。儀器名稱型號生產(chǎn)廠商冰箱BCD215KALM青島海爾股份有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱DH6000BH天津市泰斯特儀器有限公司電子天平ALB224賽多利斯科學(xué)儀器有限公司單人單面凈化工作臺SW—CJ—1FD蘇州凈化設(shè)備有限公司恒溫振蕩器ZD—85A常州澳華儀器有限公司型電熱鼓風(fēng)干燥箱101—2AB天津市泰斯特儀器有限公司型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG—9240上海一恒科技有限公司紫外可見分光光度計721GG上海儀電分析儀器有限公司高速臺式離心機(jī)TGL—16B上海安亭科學(xué)儀器廠、純化將從貴州茅臺酒廠取樣到的樣品搗碎后， mL無菌水中制備成1%的菌懸液，震蕩培養(yǎng)30 min用無菌蒸餾水稀釋101010105四個梯度，然后再用無菌吸管吸取100 μL菌懸液滴入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布均勻，分別在30 176。C及50176。C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，不同處理均作3個重復(fù)。觀察培養(yǎng)皿上菌落形成情況，選取優(yōu)勢菌株和透明圈明顯的菌株，CMCNa培養(yǎng)基上用兩區(qū)劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離和純化。觀察牛肉膏蛋白胨各培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)特征，拍照并作好詳細(xì)記錄。將純化的菌株接種到纖維素鈉(CMCNa)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基的上，每個培養(yǎng)基點2 個樣，不同處理均作3個重復(fù)。分別于30176。C、50176。C下倒置培養(yǎng)2 d，每天檢測觀察各菌株的菌落狀況，最后通過滴加革蘭氏碘液，靜置10 min，傾去染液，將平板置于白色背景下，觀察透明圈產(chǎn)生的清晰度，測量菌落及淺色透明圈半徑（R，mm），并拍照記錄。根據(jù)透明水解圈半徑和菌落半徑的比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株繼續(xù)進(jìn)行研究。最后保存菌落半徑與透明圈比值大于2：4的菌株于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，其活性與透明圈半徑/菌落半徑（R/r）在冰箱中4176。C條件下保存，以作下一步的研究[15]。從斜面保存培養(yǎng)基挑取菌株單菌落， mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，振蕩培養(yǎng)12 h，然后取100 μL 菌懸液置入另外盛有10 mL LB 液體培養(yǎng)液的試管中振蕩培養(yǎng)。每4 h取樣一次通過分光光度法測定菌體濃度。以未接種的LB培養(yǎng)液做空白對照，依次測定。用721G可見分光光度計，在660 nm波長處測定吸光度。然后以時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線。 1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取7支10 mL試管，編號，（500 mg/L）溶液與蒸餾水混勻，既得各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。另取試管7支，編號， mL，對好加入各試管， mL，搖勻，置于沸水中煮沸5 min。取出后置于冷水浴中冷卻，在721G型分光光度計上比色。選用520 nm波長。 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的制備管號制備標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的濃度（μg/mL）加500ug/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄液（mL）加蒸餾水量（mL）00010140280312041605200466240加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水， mL DNS試劑，于沸水浴中加熱5 min進(jìn)行顯色，取出后用流動水迅速冷卻， mL，搖勻，用721G可見分光光度計，在520 nm波長處測定吸光度。 mL蒸餾水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按同樣顯色操作為空白調(diào)零點。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)DNS (3，5二硝基水楊酸)比色法測定原理繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。2．粗酶液制備將初篩選取的菌株環(huán)取一環(huán)接種到纖維素羧甲基鈉活化培養(yǎng)液中，30176。C通過靜置培養(yǎng)、50176。C則在120 r /min下振蕩培養(yǎng)24 h，不同處理做3個重復(fù)。每24 h 取一次菌液，3500 r/min 下離心5 min，收集上清液用于測定酶活。CMC酶活力的測定：取CMC mL于比色皿中， mL 稀釋10 倍的酶液，50176。C 恒溫水浴中反應(yīng)30 min， mL DNS 試劑，沸水浴10 min， mL。在520 nm 處測OD 值，測得OD 值后查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出酶解所得葡萄糖含量，換算成酶活力值。3．濾紙崩解的測定分別用接種環(huán)取一環(huán)初篩得到的菌種，將其接種到裝有10 mL濾紙培養(yǎng)液的10mL試管中，置于30176。C、50176。C恒溫?fù)u床，120 r /min下振蕩培養(yǎng)，每天檢查記錄各菌株對濾紙的作用情況[17]。觀察其酶活力的分解強(qiáng)度，以+、—標(biāo)示作用情況，本方法是以肉眼觀察為主，主觀意識為主，結(jié)果的表示只能為試驗提供參考，不能作評判的依據(jù)，但用于篩選目標(biāo)菌株有很大的適用性，再配以其他方法，不是為有效的手段。具體表示：+濾紙邊緣膨脹；+ + 濾紙整齊膨脹并下彎； + + + 濾紙不定形；+ + + + 全成糊狀。若濾紙不到2 4 h 全部分解，則記下達(dá)到全部被分解的時間，拍照記錄。4．CMC酶活力測定酶液的稀釋：取大號試管13只，用移液管吸取離心后的酶1 mL，加水24 mL，搖勻。還原糖的測定：取刻度試管26只， mL，CMC緩沖液（檸檬酸緩沖液） mL。每次測酶活時均設(shè)一個總的空白樣，即在試管中不加底物和酶液， mL，用作測量吸光度時的參比。對每個樣品都設(shè)一個參照樣， mL蒸餾水， mL相應(yīng)樣品的粗酶液。在容積為10 mL的試管管中，加入1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液于50176。C和30176。C 恒溫水浴中預(yù)熱5 min后，搖勻，將試管置于水浴鍋中，50176。C恒溫水浴加熱，充分反應(yīng)30 min。將試管從水浴鍋取出后， mL DNS試劑，然后又放入水浴鍋，沸水浴5 min。迅速冷卻試管， mL。在560 nm 波長處測吸光度并做好記錄。定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活單位，即在50176。C下，每1 g纖維素酶曲在1 min內(nèi)水解CMC，生成1 ug葡萄糖的酶活性稱作纖維素酶活力單位，記作U。葡萄糖量=[(mg/mL)?30 min]1/10式中 葡萄糖量：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的（mg）；1/10： 稀釋倍數(shù)；30： 糖化時間（min）。3結(jié)果與分析、純化結(jié)果利用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，分101010105四個不同稀釋梯度，2至3組平行，從茅臺酒丟糟、301車間丟糟、酒曲、酒醅、茅臺有機(jī)高粱基地土壤、廢舊稻草樣品中初步分離到近千個菌株，在觀察菌落生長狀況、菌落形態(tài)特征的同時。細(xì)菌的純化一般采用二區(qū)劃線法，通過這種方式，進(jìn)一步分離所篩選的菌種。 菌落計數(shù)統(tǒng)計菌株編號稀釋102（計數(shù)） 稀釋103（計數(shù)） 稀釋 104（計數(shù)） 稀釋105（計數(shù)）茅臺酒糟B1200328244248301車間酒糟B2400以上1051423454713茅臺大曲B3700以上741083238414茅臺酒醅B41241651722411茅臺有機(jī)高粱基地土壤B5500以上2012743456817廢舊稻草B6連片連片2893213257根據(jù)菌落數(shù)30300為最佳，B1的最佳稀釋度為10103，B2的最佳稀釋度為10104，B3的最佳稀釋度為10104，B4的最佳稀釋度為10103，B5的最佳稀釋度為10104，B6的最佳稀釋度為105。通過對近千個菌株的初篩，用羧甲基纖維素鈉鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，滴加革蘭氏碘液有透明圈的244株。其中， cm，BL595透明圈與菌落半徑比值最大的，達(dá)到15。透明圈與菌落半徑比值超過10的有12株，透明圈與菌落半徑比值超過5的有103株。50176。C培養(yǎng)條件下的，選取透明圈半徑超過2 cm，透明圈與菌落半徑比值大于3的7株菌；30176。C培養(yǎng)條件下的， cm，透明圈與菌落半徑比值大于5的6株菌。共選取13株菌進(jìn)行纖維素酶活力等測定。 幾株細(xì)菌CMC培養(yǎng)基透明圈情況將透明圈與菌落半徑比值較突出的13株菌，根據(jù)初篩過程順序分別