【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 板上的各組分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上。（3）用被檢蛋白質(zhì)相應(yīng)的特異性抗體（稱第一抗體）與NC膜上的各組分蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)。于是，特異性抗體就與NC膜上相應(yīng)的特異性蛋白質(zhì)結(jié)合成抗原—抗體復(fù)合物。（4）用與第一抗體相對(duì)應(yīng)的特異性第二抗體，將它進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記或放射性核素標(biāo)記。將這種標(biāo)記的第二抗體與第一抗體—抗原復(fù)合物反應(yīng)。于是標(biāo)記了的第二抗體就與第一抗體進(jìn)行特異性的結(jié)合。形成了三種物質(zhì)的三元復(fù)合物。（5）印跡信號(hào)的檢測(cè)： ① 顯色檢測(cè)：加入相應(yīng)的底物，在堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶的作用下，使底物反應(yīng)產(chǎn)生具有一定顏色的物質(zhì)。 ② 放射性自顯影檢測(cè)：用于放射性核素標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)。： （1）蛋白質(zhì)特別是微量蛋白質(zhì)的定性檢測(cè)：一復(fù)合物組分蛋白質(zhì)中含有微量的目的蛋白質(zhì)時(shí)，可用Western blotting 進(jìn)行定性檢測(cè)。 （2）特異蛋白質(zhì)的半定量分析：特異蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)印跡質(zhì)顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)量蛋白質(zhì)比較，經(jīng)掃描方法可進(jìn)行半定量測(cè)定。 什么是斑點(diǎn)印跡（DNA點(diǎn)雜交）？什么是細(xì)胞原位雜交？答：斑點(diǎn)印跡（dot blotting）:將待測(cè)DNA或RNA，不需經(jīng)電泳分離直接點(diǎn)樣在NC膜使之呈點(diǎn)狀。再用標(biāo)記的已知堿基順序的探針與之雜交。如出現(xiàn)陽(yáng)性雜交體，根據(jù)探針的堿基順序，按堿基配對(duì)規(guī)則就可確定待測(cè)DNA或RNA的存在以及它們的含量。細(xì)胞原位雜交（ISH，in situ hybridigation）：用組織切片或細(xì)胞涂片或細(xì)胞印片，對(duì)其進(jìn)行一定處理，使細(xì)胞膜通透性增加，用標(biāo)記的探針與之雜交，在細(xì)胞DNA原位置處形成雜交體。常用于腫瘤的基因診斷。 什么是PCR？基本原理是什么？答：PCR (polymerase chain reaction) 稱聚合酶鏈反應(yīng)，是由美國(guó)生化學(xué) Mullis 于1983年創(chuàng)建的方法。使一個(gè)基因片段在試管內(nèi)經(jīng) 23小時(shí)反應(yīng)后，其拷貝數(shù)可增加至百萬(wàn)倍以上，不需要經(jīng)復(fù)雜的分子克隆技術(shù)就可得到基因片段的大量拷貝，使得過(guò)去很多不能進(jìn)行的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)得以順利進(jìn)行。PCR的基本原理 利用DNA半保留復(fù)制的原理結(jié)合體外DNA在不同溫度下變性、復(fù)性的原理建立了高溫變性、低溫復(fù)性、適溫（稱延伸溫度）下合成鏈延伸的三步連續(xù)反應(yīng)的不斷循環(huán)： 1，高溫變性：94℃左右時(shí)，雙鏈DNA中兩條單鏈之間氫鍵斷裂，解開(kāi)成兩條單鏈，便于起模板作用，但又不影響3’，5’磷酸二酯鍵的穩(wěn)定性。此溫度時(shí)，單鏈DNA引物自身間的聚合也完全解開(kāi)，引物便于充分發(fā)揮作用。2. 低溫復(fù)性，便于DNA單鏈引物與單鏈模板DNA之間的結(jié)合：在55℃左右時(shí)，一對(duì)（兩條）小DNA單鏈引物中，一條引物與一條模板鏈3‘端互補(bǔ)結(jié)合。另一條引物與另一條模板鏈兩條3‘端互補(bǔ)結(jié)合。 3. 適溫下DNA鏈合成延伸：在72℃左右時(shí)，在耐熱DNApol（ Taq DNApol ）催化下，以四種dNTP為原料，從引物3’OH上開(kāi)始延長(zhǎng)合成DNA上述三步連續(xù)反應(yīng)組成一輪（個(gè)）循環(huán)，上一輪循環(huán)的產(chǎn)物又可作為下一輪循環(huán)的模板。三步連續(xù)反應(yīng)不斷循環(huán)，經(jīng)過(guò) 2530 輪循環(huán)后，擴(kuò)增基因片段的拷貝數(shù)可達(dá)到百萬(wàn)倍以上。擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度基本是兩條引物 5’端之間的 DAN片段。 PCR引物應(yīng)具備哪些條件？答：PCR引物為一對(duì)（兩條）DNA單鏈：其中一條引物與模板雙鏈DNA中的一條模板單鏈的3’端相應(yīng)部位堿基互補(bǔ)。另一條引物與另一條模板單鏈的3’端互補(bǔ)結(jié)合。 引物長(zhǎng)度：約1520個(gè)核苷酸。 引物與模板DNA非擴(kuò)增區(qū)不應(yīng)該存在堿基互補(bǔ)，否則，將產(chǎn)生一些非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。引物的 3’端堿基，一定要與模板互補(bǔ)，否則將不產(chǎn)生延伸效應(yīng)。 引物的 5’端堿基與模板的互補(bǔ)要求不十分嚴(yán)格，甚至可游離十幾個(gè)堿基而不影響 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。 PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：復(fù)性時(shí)兩條引物 5’端之間的DNA片段。 PCR的主要用途有哪些？試述之。答：（一）獲得目的基因，用于目的基因的克隆 根據(jù)目的基因兩端的堿基順序，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物從基因組DNA 或 cDNA中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段。（二）體外基因定點(diǎn)突變 根據(jù)對(duì)突變的要求（點(diǎn)突變、缺失突變等）設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的突變引物，然后進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，最后將分段擴(kuò)增產(chǎn)物再融合擴(kuò)增。于是定點(diǎn)突變（引物）就嵌入到基因組中。（三）對(duì)微量DNA及RNA進(jìn)行分析 在PCR未出現(xiàn)之前，由于微量DNA信號(hào)太弱，不易進(jìn)行分析 。PCR具有高度敏堿性，微量DNA（哪怕是一滴血或一根頭發(fā)中的一個(gè)DNA分子）經(jīng)PCR擴(kuò)增后可得到基因的大量拷貝，便于進(jìn)行定性及定量分析。這在基因診斷、法醫(yī)中犯罪對(duì)象認(rèn)定及親子鑒定等方面，都有廣泛的應(yīng)用前景。（四）DNA序列測(cè)定 從基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得相應(yīng)的目的DNA片段后，通過(guò)DNA自動(dòng)測(cè)序儀或手工操作法進(jìn)行DNA直接測(cè)序。也可用核酸雜交等方法進(jìn)行間接測(cè)序。（五）基因點(diǎn)突變分析 1，引物特異性PCR2，PCRSSCP（單股鏈構(gòu)象多態(tài)性） 3，等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)治?PCRASO) 4，基因芯片技術(shù) 什么是引物特異性PCR？什么是PCR—ASO？答：（1）、引物特異性PCR：從基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因，針對(duì)目的基因突變點(diǎn)的堿基性質(zhì)設(shè)計(jì)合成 3‘ 端與之互補(bǔ)的引物，又進(jìn)行PCR擴(kuò)增，于是，突變陽(yáng)性的基因有擴(kuò)增產(chǎn)物，突變陰性的基因，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，稱之為引物特異性PCR。等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)治?PCRASO)： （2）、PCR 擴(kuò)增突變基因，合成針對(duì)突變點(diǎn)的探針，將它與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，雜交陽(yáng)性說(shuō)明有相應(yīng)的基因突變存在。1 什么是RT—PCR？什么是原位PCR？答：（一）RT—PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR） RT—PCR（reverse transcription PCR）是將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與 PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。首先，以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，經(jīng) PCR 擴(kuò)增目的基因。目前，RT—PCR是真核細(xì)胞mRNA進(jìn)行定性及半定量分析的有效方法。（二）原位PCR 原位PCR（in situ PCR）是在組織切片或細(xì)胞涂片的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用特異性探針與之進(jìn)行原位核酸雜交，從而檢測(cè)出待測(cè)DNA或RNA的存在以及存在的部位。雖然這種方法的靈敏度不高，但它是目的基因定位的一個(gè)最佳方法。1 非探針類實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理是什么？答：原理：在常規(guī)PCR時(shí)，加入特殊的熒光染料SYBR Green，這種染料能與雙鏈DNA的小溝區(qū)域結(jié)合。當(dāng)這種染料未與DNA結(jié)合處于游離狀態(tài)時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度極低。一旦它與雙鏈DNA通過(guò)小溝區(qū)域結(jié)合后，熒光信號(hào)大大增強(qiáng)，約為游離時(shí)的1000倍。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA越多，熒光信號(hào)就越強(qiáng)，下一輪循環(huán)變性時(shí)，雙鏈DNA能形成單鏈，熒光近消失，待這一輪循環(huán)結(jié)束，產(chǎn)生雙鏈DNA時(shí)，又出現(xiàn)大量熒光。這樣，實(shí)時(shí)記錄了熒光量即DNA量。1 探針類實(shí)時(shí)熒光定量PCR有哪三種？試述TaqMan探針?lè)ǖ幕驹怼４穑焊鶕?jù)使用探針不同又分為：TagMan探針?lè)?，分子信?biāo)探針?lè)盁晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移探針?lè)āaqMan探針?lè)ɑ驹恚孩僭诔Ｒ?guī)PCR反應(yīng)體系中，加入一條能與模板DNA特異結(jié)合的TagMan探針，這個(gè)探針的5｀端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)R（reporter， R），3｀端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)Q（quencher，Q）。②當(dāng)探針上報(bào)告基團(tuán)R及淬滅基團(tuán)Q同時(shí)存在時(shí)，無(wú)熒光信號(hào)釋放。當(dāng)R基團(tuán)與Q基團(tuán)分離時(shí)，R基團(tuán)便能產(chǎn)生熒光信號(hào)。③PCR擴(kuò)增時(shí)，DNA鏈合必延長(zhǎng)，當(dāng)遇到與模板DNA結(jié)合的探針時(shí)，Taq DNApol發(fā)揮5’ 3’核酸外切酶活性，將探針5‘ 端的R基團(tuán)水解下來(lái)，產(chǎn)生熒光。由熒光檢測(cè)系統(tǒng)收集。探針余下部分，繼續(xù)由Taq DNApol 水解切除。PCR擴(kuò)增繼續(xù)向前，直至此循環(huán)結(jié)束。在下一輪循環(huán)，產(chǎn)生上述同樣過(guò)程，收集熒光信號(hào)。④這樣，TagMan 探針就在每一輪PCR擴(kuò)增時(shí)，就實(shí)時(shí)測(cè)定PCR產(chǎn)物的量（熒光量）。1 什么是基因組DNA文庫(kù)？什么是cDNA文庫(kù)？答：從細(xì)胞中提取總基因組DNA，用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶酶切，得到大小不同的許多各種基因片段，將這些基因片段分別與相應(yīng)的基因載體（如噬菌體載體）連接重組。于是形成各種重組體，將所有這些重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞中（如大腸桿菌），對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，從而獲得含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體，它可以涵蓋該種生物基因組的全部基因信箱，稱之為基因組DNA文庫(kù)。從細(xì)胞（液）中提取mDNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的各種cDNA 。然后將這些cDNA分別與相應(yīng)的載體（質(zhì)粒載體或噬菌體載體）連接，得到各種重組cDNA。將所有這些重組cDNA轉(zhuǎn)錄入合適的受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行克隆培養(yǎng)，從而獲得多克隆cDNA 片段的混合體。它包含了一種組織細(xì)胞中全部mDNA信息。稱之為cDNA文庫(kù)。1 什么是基因芯片？什么是蛋白質(zhì)芯片？答：一、基因芯片（gene chip）技術(shù)是以反向點(diǎn)雜交為基礎(chǔ)而建立的一種高效高通量的自動(dòng)化分析技術(shù)。其基本原理是： 針對(duì)各種基因突變類型合成各種探針以及正常探針，但不對(duì)它們進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)自動(dòng)化微點(diǎn)樣技術(shù)將這些未標(biāo)記的探針依次排列布陣在固相支持載體玻片或尼龍膜上。將待測(cè)樣品DNA（常來(lái)自 PCR）進(jìn)行熒光標(biāo)記，與固定在固相支持載體上的各種探針進(jìn)行微雜交，熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描收集熒光信號(hào)（熒光共聚焦掃描），經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行比較分析處理，就可得出檢測(cè)結(jié)果。由于探針布陣密集，1cm2 內(nèi)可布陣數(shù)萬(wàn)個(gè)基因，同一時(shí)間的一次檢測(cè)可分析大量基因，故稱基因芯片。二、蛋白質(zhì)芯片 將針對(duì)各種不同蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體蛋白作為探針，將這些各種蛋白探針用微點(diǎn)樣技術(shù)布陣在固相支持載體尼龍膜等上面，形成蛋白質(zhì)芯片。將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記并與芯片上的各種蛋白質(zhì)探針進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，于是特異的蛋白質(zhì)與它特異的抗體（蛋白探針）之間產(chǎn)生特異的抗原—抗體親和反應(yīng)而結(jié)合。此時(shí)芯片上就可產(chǎn)生特定的熒光信號(hào)，通過(guò)激光掃描收集熒光信號(hào)，再經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理就可得出檢測(cè)結(jié)果。第二十一章 DNA重組及DNA重組技術(shù) 什么是基因克隆？答：基因克隆：在體外將目的基因與載體DNA連接起來(lái)形成重組DNA（基因重組），然后采用適當(dāng)?shù)奈锢怼⒒瘜W(xué)及生物學(xué)方法將重組DNA導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性受體細(xì)胞進(jìn)行克隆培養(yǎng)，于是，目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)不斷地復(fù)制得到大量基因拷貝，并轉(zhuǎn)錄和翻譯出相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)，這一過(guò)程稱基因克隆及克隆基因的表達(dá)。 限制性核酸內(nèi)切酶（Ⅱ型）的作用特點(diǎn)有哪些？答：（1）RE作用于DNA分子內(nèi)部，使兩條單鏈水解切斷，分別產(chǎn)生5’P端 及3’OH端。 （2）RE的識(shí)別酶切部位，具有特殊的堿基順序，通常為46個(gè)堿基的回文結(jié)構(gòu)（Palindrome），也稱反向重復(fù)序列。如EcorⅠ的識(shí)別順序?yàn)椋? 5’—G A A T T C—3’ 3’—C T T A A G—5’（3）切割方式： 在識(shí)別部位，切割DNA雙鏈，產(chǎn)生兩種不同的末端： ① 粘性末端（粘端）：在識(shí)別部位對(duì)稱的不平齊切開(kāi)DNA雙鏈，產(chǎn)生單鏈突出的互補(bǔ)粘性末端： a，若從5’ 端切割，產(chǎn)生5’端突出的粘性末端，如 BamHⅠ 5‘—GGATCC—3’ 3’—CCTAGG—5’b，若從3’端切割，產(chǎn)生3’端突出的粘性末端。如PstⅠ 5‘—CTGCAG—3’ 3’—GACGTC—5’ ②平頭末端（鈍性末端） ：在識(shí)別的堿基部位，對(duì)稱地平齊切開(kāi)DNA雙鏈。如Sma Ⅰ 5‘—CCCGGG—3’ 3’—GGGCCC—5’ 什么是同尾酶？什么是同裂酶？答：有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，這些酶彼此互稱為同尾酶（isocaudarner）。所產(chǎn)生的相同的粘性末端稱為配伍末端。來(lái)源不同的限制性內(nèi)切酶酶，但能識(shí)別和切割同一序列，這些酶稱同裂酶或異源同工酶。 什么是基因載體？答：基因載體：外援目的基因一般很難自由進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，即使能進(jìn)入，也很難在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。為此，就要尋找一種特殊結(jié)構(gòu)的DNA分子,它既能將外源目的基因帶入受體細(xì)胞內(nèi)，還能引導(dǎo)目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，稱此特殊的DNA分子為基因載體，簡(jiǎn)稱載體（vector）。根據(jù)載體功能不同又分為克隆載體（cloning vector）及表達(dá)載體（expression）。 什么是克隆載體？它具有哪些基本特點(diǎn)？答：克隆載體是用來(lái)在宿主細(xì)胞中獲得目的基因的大量拷貝?？寺≥d體應(yīng)具備的基本特點(diǎn) （1）具有復(fù)制起始點(diǎn)：它能使載體在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制，同時(shí)能使帶入的外源目的DNA片段進(jìn)行同步復(fù)制擴(kuò)增。（2）含有可供篩選用的選擇標(biāo)志（selection marker）常稱遺傳標(biāo)志，便于對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞時(shí)，并非每個(gè)細(xì)胞都轉(zhuǎn)化成功，對(duì)轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞進(jìn)行篩選，就依賴這些選擇標(biāo)志。（3）含有一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，便于目的基因插入。若載體中某一段特異核苷酸序列，含有多種限制性內(nèi)切酶（RE）的單一酶切位點(diǎn)，稱這段序列為多克隆位點(diǎn)（MCS,multiple cloning sites）。 什么是表達(dá)載體？什么是原核表達(dá)載體？它的基本特點(diǎn)是什么？答：表達(dá)載體是用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源目的基因。根據(jù)表達(dá)宿主細(xì)胞不同，又分為原核表達(dá)載體（prokaryotic expression vector）及真核表達(dá)載體（