【文章內(nèi)容簡介】 ，西醫(yī)治療骨質(zhì)疏松的藥物雖然很多，但均有不同程度的副作用，不能滿足臨床治療的需要。中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松具有副作用小的特點，并且在修復(fù)骨質(zhì)，提高骨量的同時，還能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、免疫等多個系統(tǒng)的功能狀態(tài)，可起到標本兼治、綜合治療的目的。中藥小復(fù)方骨疏丹正是基于這一思想建立起來的，具有較強的抗骨質(zhì)疏松作用，但因浸膏服用量大，浸膏中含有大量的吸濕性成分，不利于制成現(xiàn)代制劑，因此考慮在不降低藥效的基礎(chǔ)上，擬采用大孔吸附樹脂法對骨疏丹方劑進行純化，以有效降低浸膏率，減少浸膏的吸濕性。 研究思路本文通過指標成分總黃酮與總香豆素的靜態(tài)比吸附量、解吸率從4種大孔吸附樹脂中優(yōu)選出對總黃酮和總香豆素吸附、解吸能力均較強的D101大孔吸附樹脂；采用L9(34)正交設(shè)計試驗分別優(yōu)選了D101大孔吸附樹脂純化骨疏丹的最佳吸附、解吸工藝；通過HPLC圖譜驗證了最佳純化工藝中活性成分柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA的含量保留率；最后采用確定工藝考察了D101大孔吸附樹脂純化骨疏丹方劑的重復(fù)使用次數(shù)，為工業(yè)上大規(guī)模純化骨疏丹提取物提供了指導(dǎo)意義。第二章 實驗部分 實驗材料 儀器 JascoPU980型高效液相色譜儀 日本分光公司JascoUV975型紫外可見檢測器 日本分光公司ANASTAR CHROMATOGPAPHY色譜工作站 Scientific System Inc.752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司HY2調(diào)速多用振蕩器 國華儀器有限公司AL104分析天平 德國梅特勒公司YP電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司KQ300DE型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司SZ93自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠TGL16C型離心機 上海手術(shù)器械廠 試劑甲醇(色譜純) 天津康科德科技有限公司乙腈(色譜純) 天津康科德科技有限公司95%乙醇(分析純) 沈陽市富康消毒藥劑廠柚皮苷(純度99%以上) 自制朝藿定B(批號A0229) 成都曼斯特生物科技有限公司淫羊藿苷(批號110822200305) 中國藥品生物制品檢定所蛇床子素(批號110826201013) 中國藥品生物制品檢定所丹參酮ⅡA(批號110826200513) 中國藥品生物制品檢定所雙蒸水 自制D101型大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司AB8型大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司DM130型大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司DA201型大孔吸附樹脂 滄州寶恩化工有限公司 藥材 淫羊藿、骨碎補、蛇床子、丹參4味藥材均經(jīng)過我校中藥學(xué)院路金才教授鑒定。 淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornum ，產(chǎn)地甘肅，購自亳州千草藥業(yè)有限公司。骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortuner (Kunze) J. ，產(chǎn)地湖北，購自河北祁新中藥顆粒飲片廠。蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri (L.)，產(chǎn)地江蘇，購自。丹參為為雙子葉植物唇形科植物丹參Salbia miltiorrhiza ，產(chǎn)地山東，購自。將上述各單味藥材粉碎成粗粉，備用。 上柱藥液的制備按處方比例取藥材適量，加12倍量75%，提取2次，制得提取液后減壓濃縮至無醇味后，ml1，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ现俺曁幚?0分鐘使其溶解。 指標成分的含量測定 總黃酮的含量測定 對照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對照品適量。 標準曲線的繪制、()于10ml量瓶中，各加入1%AlCl3(甲醇)，搖勻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，按照紫外可見分光光度法，于414nm處測定吸光度。以對照品的濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線?；貧w方程為：y=，r=。結(jié)果表明：～。 樣品的測定精密量取上柱藥液、以及吸附解吸后藥液以甲醇定容，搖勻后測定。 對照品溶液的制備精密稱取蛇床子素對照品適量。 標準曲線的繪制、、()于10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，于320nm處測定吸光度。以對照品的濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。回歸方程為：y=，r=。結(jié)果表明：～。 樣品的測定精密量取上柱藥液、以及吸附解吸后藥液以甲醇定容，搖勻后測定。 HPLC同時測定5種活性成分[23] 5種活性成分的結(jié)構(gòu)式本課題組在骨疏丹促成骨細胞增殖試驗中發(fā)現(xiàn)以下5種成分都具有較好的促成骨細胞增殖活性，其結(jié)構(gòu)式如圖21所示，因此將以下5種成分的保留率作為驗證試驗的指標。把柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA的結(jié)構(gòu)式畫上。 柚皮苷 朝藿定B 淫羊藿苷 蛇床子素丹參酮ⅡA 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：Diamonsil (2)柱(250mm，5μm)；流動相：乙腈(A)%冰醋酸水溶液(B)；梯度洗脫順序如下： Time(min)A(%)B(%)0 1882191940202872352872375070507030547030558020658020檢測波長：270nm 柱溫：25℃ 流速：進樣量：20μl 混合對照品溶液的制備精密稱取柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇定容，、將上述混合對照品儲備液制成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，得各組分的線性范圍和回歸方程見表21所示。 表21 活性成分的線性范圍和回歸方程線性范圍回歸方程γ柚皮苷～Y=2107X20424朝藿定B～Y=2107X39740淫羊藿苷～Y=3107X35006蛇床子素～Y=1107X14347丹參酮ⅡA～Y=6107X26167 供試品溶液的制備精密量取上柱藥液、以及吸附解吸后藥液以甲醇定容。 樣品的測定分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液20μl，注入液相色譜儀中，對照品溶液，上柱藥液色譜圖如圖22(a)，22(b)所示，測定5個色譜峰的峰面積，通過外標一點法計算含量。 圖22(a):對照品色譜圖 圖22(a):上柱藥液色譜圖 浸膏的測定 精密吸取上柱藥液及吸附洗脫后溶液適量至已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干水分后，將其放入105℃烘箱中，立即稱重。 大孔吸附樹脂的選擇 大孔樹脂的靜態(tài)吸附試驗： 取預(yù)處理好的4種型號D101 (非極性)、AB8(弱極性)、DM130(中極性)、DA201(極性)干樹脂各1g，精密稱定，分別置100ml具塞錐形瓶中，精密加入上柱藥液()25ml后放于振蕩器上，頻率100次min1，每隔20min振搖20s，間隔振搖4h，室溫靜置24h，使其達到飽和吸附，傾出吸附后的上清液，測定總黃酮、總香豆素的含量，計算樹脂的飽和吸附量。飽和吸附量(mgg1)干樹脂={上樣液中總黃酮(總香豆素)