【正文】 yed to investigate effects of separation and purification for the total flavonoisd and coumarins from Gushudan extracts with the recovery rate of the total flavonoids and coumarins,degree of purity as index. At last, the recovery rate of five active pound was verify by HPLC. The result showed that D101 type resin had better adsorption and desorption properties to total flavonoids and coumarins of Gushudan the optimal purifying condition was as follows: the Gushudan extracts solution of volumes of the resin(h1，上樣后立即洗脫，水洗體積為7BV，棄去水洗液后，用5BV80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，結(jié)果總黃酮、樹脂可重復(fù)使用15次以上需再生。目 錄摘 要 1Abstracts 2第一章 前 言 3 骨疏丹處方簡(jiǎn)介及研究概況 3 處方各味藥材的介紹 3 骨疏丹處方的藥理學(xué)研究 3 配伍機(jī)制研究 4 促成骨細(xì)胞活性成分群研究 4 提取工藝與質(zhì)量控制方法 4 中藥的現(xiàn)代除雜技術(shù) 5 大孔吸附樹脂 5 大孔吸附樹脂的類型 5 大孔吸附樹脂分離技術(shù)操作流程 6 影響大孔吸附樹脂技術(shù)的因素 6 大孔吸附樹脂的優(yōu)缺點(diǎn) 7 本文的立題依據(jù)及研究思路 7 立題依據(jù) 7 研究思路 8第二章 實(shí)驗(yàn)部分 9 實(shí)驗(yàn)材料 9 儀器 9 試劑 9 藥材 10 10 指標(biāo)成分的含量測(cè)定 10 總黃酮的含量測(cè)定 10 對(duì)照品溶液的制備 10 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 10 樣品的測(cè)定 10 10 對(duì)照品溶液的制備 10 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 11 樣品的測(cè)定 11 HPLC同時(shí)測(cè)定5種活性成分 11 5種活性成分的結(jié)構(gòu)式 11 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 11 混合對(duì)照品溶液的制備 12 供試品溶液的制備 12 樣品的測(cè)定 13 浸膏的測(cè)定 13 大孔吸附樹脂的選擇 13 大孔樹脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn) 14 大孔樹脂的靜態(tài)解吸附試驗(yàn) 14 試驗(yàn)結(jié)果 14 D101型樹脂吸附工藝研究 15 吸附工藝正交設(shè)計(jì) 15 吸附工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 15 16 驗(yàn)證試驗(yàn) 17 D101型樹脂洗脫工藝研究 18 洗脫工藝正交設(shè)計(jì) 18 洗脫工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 19 洗脫工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析 19 驗(yàn)證試驗(yàn) 21 大孔吸附樹脂的重復(fù)使用次數(shù) 23第三章 討論 24 討論 24 正交試驗(yàn)指標(biāo)成分的確定 24 上樣溶液溫度 24 上樣濃度的選擇 24 預(yù)吸附時(shí)間的確定 24 吸附正交試驗(yàn)中上樣體積因素下水平的選擇及確定 24 洗脫正交試驗(yàn)中洗脫體積因素下水平的選擇 25 洗脫流速的確定 25第四章 結(jié)論 26參考文獻(xiàn) 27致 謝 28摘 要本文建立了骨疏丹提取物的大孔吸附樹脂純化工藝，通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)試驗(yàn)以總黃酮、總香豆素保留率及純度為指標(biāo)，對(duì)影響大孔樹脂富集純化因素進(jìn)行優(yōu)化，最后通過HPLC法測(cè)定的5個(gè)活性成分含量之和的保留率將最優(yōu)條件加以驗(yàn)證。結(jié)果表明：D101型大孔吸附樹脂對(duì)骨疏丹中總黃酮、總香豆素的吸附、解吸能力較強(qiáng)。ml1(生藥濃度)，室溫上樣，吸附速度為2BV此純化工藝穩(wěn)定可靠，為工業(yè)上大規(guī)模純化骨疏丹提取物提供了科學(xué)依據(jù)。ml1of the Crude drug oncentration)was loaded with a speed of 2 times volume of the resinh1. The results showed that the degree of purity total flavonoisd and coumarins is higher by times, and the resin is reuseable for 15 optimized process was stable and feasible. For industry purification Gushudan extract offer scientific basis.Keyword: Gushudan, macroporous adsorption resin, purificati第一章 前 言 骨疏丹處方簡(jiǎn)介及研究概況骨疏丹處方是根據(jù)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理，以中醫(yī)藥理論和多年臨床實(shí)踐為基礎(chǔ)，利用其“中藥小復(fù)方精選系統(tǒng)操作技術(shù)平臺(tái)[1]”和“《普濟(jì)方》數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)”精心擬定而成，由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、蛇床子、丹參四味中藥組成。用于肝腎不足證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。 處方各味藥材的介紹淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)、箭葉淫羊藿(Epimedium sagittatum( Zucc.) Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、或朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)的干燥葉，夏、秋季莖葉茂盛時(shí)采集，曬干或陰干。有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨之效，用于治療筋骨痿軟、麻木拘攣[2]。骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze) J. ，呈扁平長(zhǎng)條狀，多彎曲，有分枝，表面覆蓋深棕色的小鱗片，柔軟如毛，經(jīng)火燎著呈棕褐色或暗褐色。骨碎補(bǔ)中含有柚皮苷、木犀草素7OβD葡萄糖醛酸苷、咖啡酸4OβD吡喃葡萄糖苷、4OβD吡喃葡萄糖基香豆酸、對(duì)羥基反式肉桂酸、反式桂皮酸、3,4二羥基苯甲酸、5羥甲基糠醛、蔗糖等[5]。果實(shí)為雙懸果細(xì)小，呈橢圓形。蛇床子含有多種化學(xué)成分，主要含香豆素類化合物，此外還有色原酮類，苯并呋喃類，糖類，以及萜醇類等多種化合物[7]。[8]藥典?（7071）。脂溶性成分主要包含丹參酮I、丹參酮Ⅱa、丹參酮Ⅱb、隱丹參酮等，水溶性成分主要為酚酸類物質(zhì)，其中包含：丹參素、丹參酸乙、丹參酸丙、丹參酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸[9]。結(jié)果表明，給予骨疏丹提取物后，高、中劑量給藥組大鼠的骨密度明顯增加，堿性磷酸酶活性明顯降低，血清骨鈣素、雌二醇水平有顯著性的提高，提示骨疏丹方劑可有效抑制過高的骨轉(zhuǎn)換率，促進(jìn)骨形成而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用；給藥高劑量組的骨鈣、骨磷含量與模型組相比均顯著增加，骨干重、去脂干重及灰重有顯著增加的趨勢(shì)。骨質(zhì)疏松癥臨床以疼痛為主，采用醋酸扭體法考察了骨疏丹方劑的鎮(zhèn)痛作用。 配伍機(jī)制研究應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的成骨樣細(xì)胞UMR106活性檢測(cè)技術(shù)，以促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖和分化的作用為活性檢測(cè)指標(biāo)，確定骨疏丹方劑以75%乙醇回流提取所得提取物具有較強(qiáng)的促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的增殖與分化的作用；在此基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)骨疏丹方劑進(jìn)行了拆方研究，考察了16個(gè)子方對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖和分化的作用，從細(xì)胞水平驗(yàn)證了骨疏丹組方中四種單味藥材之間君臣佐使的配伍作用，確定了骨疏丹方劑各味藥用量的最佳配比[10]。 促成骨細(xì)胞活性成分群研究[10]采用薄層色譜、硅膠柱色譜、ODS柱色譜等現(xiàn)代分離技術(shù)，以成骨樣細(xì)胞UMR106的增殖與分化為活性追蹤指標(biāo)，對(duì)骨疏丹方劑中的活性成分(群)進(jìn)行了追蹤分離。從蛇床子的主要活性部位氯仿層分離純化得到了蛇床子素、β谷甾醇、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素。丹參的主要活性部位為氯仿層。香豆素類化合物蛇床子素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素具有促成骨樣細(xì)胞增殖和分化的作用。丹參酮ⅡA具有顯著的促成骨樣細(xì)胞分化作用。經(jīng)過綜合評(píng)價(jià)確立了骨疏丹方劑的最優(yōu)醇提工藝為12倍量的75%乙醇為提取溶劑，提取3次，每次90min[10]。在此基礎(chǔ)上，又以活性指標(biāo)成分柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、和丹參酮ⅡA的含量，以及總黃酮、總香豆素及浸膏重量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，又將最佳提取工藝優(yōu)化為2次，其他提取條件不變(待發(fā)表)。 中藥的現(xiàn)代除雜技術(shù) 由于醇沉的沉淀面廣，除雜專屬性差，且具有成分高，工藝周期長(zhǎng)，不便于連續(xù)化生產(chǎn)，成品穩(wěn)定性差等特點(diǎn)，逐漸被一些現(xiàn)代除雜技術(shù)所取代，如膜分離技術(shù)，大孔吸附樹脂技術(shù)和高速離心技術(shù)等。而史萬(wàn)忠等采用DM301大孔吸附樹脂純化補(bǔ)腎方(何首烏、淫羊藿苷、骨碎補(bǔ)等），使有效成分總黃酮得到較好富集[14]。張霄翔等采用D101樹脂純化丹參總酚酸，%，[16]。 大孔吸附樹脂 大孔吸附樹脂是二十世紀(jì)六十年代發(fā)展起來(lái)的一類具有良好吸附性能的不含離子交換基團(tuán)的有機(jī)高聚物吸附劑[17]，具有很好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過物理吸附