【文章內(nèi)容簡介】 中，使蛋白質(zhì)變性后與 DNA 分開。 抗氧化物酶抗氧化系統(tǒng)是機體清除體內(nèi)多余的活性氧、保護自身免受氧化損傷的重要體系，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶（POD）起主要作用 [28]。 超氧化物歧化酶(SOD)超氧化物歧化酶( superoxide dismutase ，簡稱 SOD) ，是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡機體內(nèi)的氧自由基，己成為化學(xué)及生物化學(xué)研究領(lǐng)域中熱門的研究課題。作為生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的清潔劑，SOD 在防輻射、抗老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能，在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用。目前，世界各地學(xué)者對 SOD 的研究方興未艾，深入研究 SOD 不僅有著重大的理論意義，也有著重大的實際應(yīng)用價值 [29~30]。到現(xiàn)在為止,人們已從細菌、原生動物、藻類、霉菌、植物、昆蟲、鳥、魚類和哺乳動物等生物體內(nèi)分離得到 SOD。根據(jù)活性中心結(jié)合的金屬離子不同， SOD 主要分為：①Cu/ZnSOD，主要存在于真核細胞的細胞質(zhì)中； ②FeSOD，主要存在于原核細胞和真核細胞的基質(zhì)中； ③MnSOD，主要存在原核細胞及少數(shù)植物細胞中。這三類 SOD 都催化超氧化物自由基 O2發(fā)生歧化反應(yīng)： O2+ O2 +2H+→H 2O2+O2而作為研究工作的基礎(chǔ)，SOD 活性的測定方法也得到不斷的改進， SOD 的活性測定方法一般分直接測定法和間接測定法。直接測定法的原理是直接測定 SOD 催化反應(yīng)的底物反應(yīng)速度或產(chǎn)物生成速度。常見的直接測定方法有EPR 法、脈沖輻解法、超氧化鉀法等。直接法需專用的儀器,故此類方法一般實驗室較難應(yīng)用。間接測定法是通過某種能產(chǎn)生 O2的系統(tǒng)，使 O2進行另一個便于檢測的反應(yīng)，測定特征波長下的光吸收變化速率，計算 SOD 對這個反應(yīng)的抑制程度從而間接定量 SOD 活性。常見的間接測定方法有黃嘌呤氧化酶細胞色素 C 法、鄰苯三酚自氧化法、微量鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶NBT 法、NBT 光還原法等。本試驗采用微量鄰苯三酚自氧化法 [31~35]。 過氧化氫酶(CAT)過氧化氫酶( Catalase, CAT, EC 1. 11. 1. 16)是一種含鐵葉琳的酶 [36]，其活性中心是血紅素，能將過氧化氫催化分解成氧和水。各種來源的 CAT 都是由四個亞基組成，F(xiàn)e (III)—原葉琳將這四個亞基連接成一條具有酶活性的多膚鏈。CAT 廣泛存在于動物、植物和微生物中，動物肝臟、紅細胞、植物葉綠體以及細菌、真菌、放線菌等中含有大量 CAT。在哺乳動物以肝和腎臟 CAT 活性最高，結(jié)締組織活性最弱。人體紅細胞中 CAT 活性是血清中的 3600 倍。它的主要生理作用就是催化過氧化氫分解為水和氧氣，使得過氧化氫不致于與 在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的 .OH。多酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)都能產(chǎn)生H2O2，H 2O2是有毒害作用的活性氧的前體。CAT 可非常有效地催化 H2O2的分解，使其失去活性氧的作用，保護機體。因此，過氧化氫酶對于減輕活性氧損傷具有一定的意義。過氧化氫酶對過氧化氫的分解如下：反應(yīng)式：2H 2O2 →2H 2O +O2↑在此反應(yīng)中，過氧化氫可同等程度的釋放和吸收電子，即它在反應(yīng)中即可作氧化劑，又可作還原劑。它是清除過氧化氫的重要酶，因此，日益受到注意和重視。CAT 活性測定的方法很多，大致可分為 3 類：(1)底物(H 2O2)消耗，如滴定法（碘滴定法。高錳酸鉀滴定法）、紫外吸收法、紫外速率法、比色法及 H2O2電極法等，有人用鋁酸錢比色法測定血清、細菌過氧化氫酶活性。(2)生成物(O2)的產(chǎn)生，如氧電極法、極譜法，測壓法等，有人用微量呼吸檢壓儀和呼吸計來檢測蜂花粉中過氧化物酶活性的。(3)免疫測定法以及電泳測定法等。在諸多的測定方法中，以紫外吸收法最為簡便，但樣品中應(yīng)無在 240nm 處有強吸收峰的物質(zhì)；而極譜法等因受實驗設(shè)備儀器條件的限制 [37~38]。本實驗采用了第一類中改進的貝爾斯—西策爾斯（Beers – Sizers ）法。 過氧化物酶（POD）過 氧 化 物 酶 是 由 微 生 物 或 植 物 所 產(chǎn) 生 的 一 類 氧 化 還 原 酶 ， 它 們 能 催 化很 多 反 應(yīng) 。 雖 在 動 物 體 內(nèi) 含 量 很 少 ， 但 也 發(fā) 揮 著 重 要 作 用 。 過氧化物酶存在于牛奶、淚液、唾液中，能抑制某些細菌生長和產(chǎn)酸，在過氧化氫存在的條件下，能催化硫氰酸鹽離子(SCN ) 發(fā)生氧化反應(yīng)，中間產(chǎn)物均是強氧化劑，進入菌體后，阻斷已糖激酶、6 磷酸葡萄糖脫氫酶等代謝通路，從而抑制細菌增。在 細 胞 內(nèi) 主 要 存 在 于 的 過 氧 化 物 酶 體 中 ,以 鐵 卟 啉 為 輔 基 ,可 催 化 過 氧 化氫 氧 化 酚 類 和 胺 類 化 合 物 ,具 有 消 除 過 氧 化 氫 和 酚 類 、 胺 類 毒 性 的 雙 重 作 用 。目 前 對 POD的 研 究 主 要 在 植 物 方 面 ， 尚 未 有 動 物 再 生 方 面 的 研 究 。 課題涉及的主要內(nèi)容（1）對渦蟲進行 SDS 脅迫處理，再生培養(yǎng)，獲得實驗材料。（2）對獲得材料進行 SOD、CAT 的提取。（3）酶活測定條件的探索。（4）SDS 脅迫濃度的探索。（5）SOD,CAT 酶活性的測定。（6）SDS 對再生過程中抗氧化系統(tǒng)影響的綜合分析。 第二章 實驗方法 實驗材料、試劑及儀器 實驗材料實驗用淡水渦蟲取自淄博市淄川區(qū)源泉鎮(zhèn)泉河頭小溪，運回實驗室后，在室溫下喂養(yǎng)在培養(yǎng)皿中（遮光） 。實驗前饑餓一周。 主要試劑及藥品藥品名稱 規(guī)格 生產(chǎn)廠家十二烷基硫酸鈉 GR Japan鹽酸 AR 煙臺市雙雙化工有限公司磷酸二氫鉀 AR 上海金山化工試劑有限公司無水乙醇 AR 萊陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠氫氧化鈉 AR 萊陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工考馬斯亮藍 G250 AR 美國 SanlandEDTA Na2 BC 北京索萊寶磷酸 AR 萊陽市雙雙化工有限公司三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） AR 北京拜爾迪生物公司焦性沒食子酸 AR 國藥集團化學(xué)試劑有限公司過氧化氫（30%） AR 萊陽市康德化工有限公司磷酸二氫鈉 AR 天津市大茂化學(xué)試劑廠牛血清蛋白 AR 上海匯申化工有限公司氫氧化鈉 AR 萊陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠 主要實驗儀器及設(shè)備儀器名稱 規(guī)格/型號 生產(chǎn)廠家紫外分光光度計 UV3310 HITACHI 公司高速冷凍離心機 Avanti J25 美國 BECKMAN 公司PH 計 PH213 上海一恒科學(xué)儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋 HWS24 上海一恒科學(xué)儀器有限公司臺式高速冷凍離心機 D37520 德國 Kendro 公司分析天平 AR2140 美國 Ohaus 公司電子天平 BS110 北京賽多利斯電子天平有限公司 試劑的配制(1)100mmol/l 過氧化氫溶液：取 30％過氧化氫 用磷酸緩沖液定溶到25ml，可置于冰箱中保存 1 天，最好現(xiàn)配先用。(2)50mmol/L， 的 TrisHCl ：稱取 Tris ，EDTA2Na ，用雙蒸水溶解至 80mL 左右，用 HCl 調(diào)節(jié) pH = 用 pH 計校正，最后定容至100mL。放入冰箱 4℃保存，此溶液可保存較長時間。 (3)50 mmol/L 鄰苯三酚 ：稱取鄰苯三酚 ，用 10mmol/L HCl 溶液溶解，定容至 10mL，避光保存，最好現(xiàn)配先用。 (4)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：牛血清血蛋白溶液（BSA）：準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白10mg，溶于蒸餾水并定容到 100ml，配制成 100μg/ml 原液。 (5)考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍 G250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇，加入100ml 85%濃 H3PO4100ml，最后用蒸餾水稀釋至 1000ml。此溶液常溫下可放置一個月。(6)各濃度 SDS 溶液：取 30mgSDS 在 500ml 容量瓶中定容，配成 60mg/l的母液，需要時稀釋成其它濃度。(7) 的磷酸緩沖液： 磷酸二氫鉀+ 氫氧化鈉，加雙蒸水稀釋，定容至 100ml。(8)TrisHCl ，TrisHCl ：48ml 的 M HCl + Tris，加雙蒸水80ml，調(diào)節(jié) pH 到 定容到 100ml。(9) 總蛋白提取液:,7mgEDTANa,15mgDTT,20ml 的甘油，80ml 水，用 NaOH 調(diào)節(jié) PH 到 。 實驗材料的獲取 渦蟲采集方法采集方法：采集中，將采集瓶中灌滿當(dāng)?shù)叵?，將水中光滑的石塊迅速拿出水面，立即將石塊底面翻到面前，仔細地觀察和尋找，當(dāng)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)時，立即用毛筆輕輕而敏捷地將蟲一個個刷入采集大廣口瓶中。當(dāng)刷過幾條渦蟲后，毛筆的筆尖被渦蟲分泌的粘液粘在一起，這時要將筆尖放入水中，用手指搓洗干凈后再繼續(xù)使用。當(dāng)天氣炎熱時采集渦蟲，除在瓶中放入巖壁上收集的水草，另在水中取一洗凈的石塊也同時放入瓶中，這樣可減輕溫度驟升和陽光的直射，防止渦蟲死亡 [39]。由于渦蟲在溫度過高時身體會發(fā)生分解，所以采集到大量渦蟲后要加入冰袋，防止回來途中因溫度高分解死亡。 渦蟲培養(yǎng)方法用涼白開水(除氯)，使用前提前一夜進行充氧。一般每天換水 1次，在培養(yǎng)器皿中放入洗凈的瓦片，每周喂食 1次，取當(dāng)天煮熟蛋黃少許，放入小燒杯中加水吹打成漿狀，每次喂一吸管。喂食時，先將一葉苔拔至燒杯一側(cè)，吸管吸蛋黃液，將吸管輕輕伸至杯底，用手指慢慢擠滿管頭，滴管在杯底一小范圍內(nèi)來回移動，使蛋黃液均勻鋪在杯底，以防止四處擴散。然后將滴管提起，離開水面。喂食時每天換水兩次，保證渦蟲正常生長。 渦蟲再生脅迫培養(yǎng)再生培養(yǎng)前，對渦蟲饑餓處理一周。(1) 渦蟲的切割方式：渦蟲在切割前停止喂食 7d。切割時用毛筆挑起渦蟲,將它放在載玻片上,靜置片刻，待渦蟲身體伸直，用雙面刀片，迅速切下頭部，此時蟲體仍在蠕動，取后端進行培養(yǎng)。(2)SDS 濃度的選?。和ㄟ^半致死濃度及預(yù)實驗確定，結(jié)果表明半致死濃度為 。所以取 SDS 濃度為： 、1mg/l、2mg/l、3mg/l 對渦蟲進行再生培養(yǎng)。(3) 渦蟲的脅迫培養(yǎng): 選取 SDS 的 6 個濃度：、1mg/l、2mg/l、3mg/l，另一組為空白對照：加煮沸并充氧除去氯氣的水。每個濃度梯度做三個平行實驗，每個實驗處理培養(yǎng) 10條已切渦蟲，每 24h 更換一次培養(yǎng)液。渦蟲再生 1d、4d、7d, 10d，再生培養(yǎng)期間不必喂食。(4)渦蟲的對照培養(yǎng)：、1mg/l、2mg/l、3mg/l ，另一組為空白對照：加煮沸并充氧除去氯氣的水。每個濃度梯度做三個平行實驗，每個實驗處理培養(yǎng) 10 條未切渦蟲，每 24h 更換一次培養(yǎng)液，處理兩天。(4)完整渦蟲處理 2d , 渦蟲再生 1d、4d、7d, 10d，分組測定 SOD,CAT 酶活。 渦蟲上清液的提取渦蟲取出后用去離子水洗滌三遍，再用 ，放入液氮中冷凍，取出后放在預(yù)冷研缽中，加入液氮研磨，加入 總蛋白提取液，充分混勻，再用 12022r/min離心機 4℃離心 10min，取上清液，分裝后于70℃下冰箱保存?zhèn)溆谩?蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣液測定 實驗原理在研究每一種酶的作用時，常用蛋白標(biāo)定結(jié)果。因此測定生物體內(nèi)可溶性蛋白含量是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有 Lowry 法和考馬斯亮藍G250 染料結(jié)合法。本實驗采用后者?？捡R斯亮藍 G250 再游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?465nm，后者在 595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0100μg/mL）,蛋白質(zhì)— 色素結(jié)合物在 595nm 波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍 G250 結(jié)合在 2