【正文】 有口無肛門，食物從口進入，不能消化的食物殘渣仍由口排出體外。該類渦蟲身體柔軟，體形較小，左右對稱，呈柳葉狀，最長可達 15 毫米，體色為黑色，褐色，紅棕色，或乳白色等；頭端呈三角形截頂狀或弓形，兩側(cè)各有一耳狀突起；背面有兩個黑色眼點 [7]，有的種類眼點多達數(shù)百個，生活于洞穴中的種類眼點退化或消失。但如果水中含有的卵蘿卜螺[Radit ovata (Draparnaud)]，即使是受到污染的水域同樣會有大量的真渦蟲分布 [15]。體前端背側(cè)有一對眼點，構(gòu)造簡單，由色素細(xì)胞和視覺細(xì)胞構(gòu)成。9～10 月,水溫 20～24 ℃。渦蟲的斷裂再生 3～11 月均可以發(fā)生,并在 5 月、9 月出現(xiàn)高峰,其水溫分別為 25 ℃、20 ℃。生殖的高峰在 6 月,最適宜的生殖溫度在 24～26 ℃。因此,渦蟲 1 年中無性生殖的增長模式不能以幾何級數(shù)表示 [1]。Neoblasts 移植實驗和 Br dU 標(biāo)記實驗等令人信服地說明Neoblasts 和胚基細(xì)胞完全一樣. 近年來, 采用 Neoblast s 的分子標(biāo)志, 如 vasa 相關(guān)基因( Dj vlg A) 、編碼 DNA 復(fù)制執(zhí)照因子的基因 ( DjMCM2) 和增殖細(xì)胞核抗原基因( Dj PCNA) 等進一步證實 Neoblasts 是渦蟲再生的唯一細(xì)胞來源 [21~ 23] . 盡管越來越的實驗證明了 Neoblasts 在渦蟲再生中的作用, 但也不得不指出, Gremigni 及其合作者巧妙地利用混倍體渦蟲證明了生殖細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)變成體細(xì)胞[24]. 這項研究表明渦蟲再生中可能出現(xiàn)細(xì)胞逆決定或轉(zhuǎn)決定現(xiàn)象.目前，淡水渦蟲作為神經(jīng)系統(tǒng)再生的動物模型己用于研究：（1）脊椎動物和無脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是腦的起源 [25]；（2）自不同物種分離的神經(jīng)基因在序列和功能上的保守程度；（3）基因和遺傳程序反應(yīng)的識別以及發(fā)生在這些動物中損傷或自然斷裂時，腦和神經(jīng)網(wǎng)完全再生的必然性；（4）再生過程中神經(jīng)遞質(zhì)對細(xì)胞的作用；（5）再生過程中發(fā)生的生理、生化事件及再生的分子機理 [26~27]。是一種無毒的陰離子表面活性劑，其生物降解度＞90％。 超氧化物歧化酶(SOD)超氧化物歧化酶( superoxide dismutase ，簡稱 SOD) ，是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡機體內(nèi)的氧自由基，己成為化學(xué)及生物化學(xué)研究領(lǐng)域中熱門的研究課題。根據(jù)活性中心結(jié)合的金屬離子不同， SOD 主要分為：①Cu/ZnSOD，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中； ②FeSOD，主要存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基質(zhì)中； ③MnSOD，主要存在原核細(xì)胞及少數(shù)植物細(xì)胞中。直接法需專用的儀器,故此類方法一般實驗室較難應(yīng)用。 過氧化氫酶(CAT)過氧化氫酶( Catalase, CAT, EC 1. 11. 1. 16)是一種含鐵葉琳的酶 [36]，其活性中心是血紅素，能將過氧化氫催化分解成氧和水。人體紅細(xì)胞中 CAT 活性是血清中的 3600 倍。因此，過氧化氫酶對于減輕活性氧損傷具有一定的意義。高錳酸鉀滴定法）、紫外吸收法、紫外速率法、比色法及 H2O2電極法等，有人用鋁酸錢比色法測定血清、細(xì)菌過氧化氫酶活性。本實驗采用了第一類中改進的貝爾斯—西策爾斯（Beers – Sizers ）法。在 細(xì) 胞 內(nèi) 主 要 存 在 于 的 過 氧 化 物 酶 體 中 ,以 鐵 卟 啉 為 輔 基 ,可 催 化 過 氧 化氫 氧 化 酚 類 和 胺 類 化 合 物 ,具 有 消 除 過 氧 化 氫 和 酚 類 、 胺 類 毒 性 的 雙 重 作 用 。（3）酶活測定條件的探索。 第二章 實驗方法 實驗材料、試劑及儀器 實驗材料實驗用淡水渦蟲取自淄博市淄川區(qū)源泉鎮(zhèn)泉河頭小溪，運回實驗室后，在室溫下喂養(yǎng)在培養(yǎng)皿中（遮光） 。放入冰箱 4℃保存，此溶液可保存較長時間。此溶液常溫下可放置一個月。(9) 總蛋白提取液:,7mgEDTANa,15mgDTT,20ml 的甘油，80ml 水，用 NaOH 調(diào)節(jié) PH 到 。由于渦蟲在溫度過高時身體會發(fā)生分解，所以采集到大量渦蟲后要加入冰袋，防止回來途中因溫度高分解死亡。然后將滴管提起，離開水面。切割時用毛筆挑起渦蟲,將它放在載玻片上,靜置片刻，待渦蟲身體伸直，用雙面刀片，迅速切下頭部，此時蟲體仍在蠕動，取后端進行培養(yǎng)。每個濃度梯度做三個平行實驗，每個實驗處理培養(yǎng) 10條已切渦蟲，每 24h 更換一次培養(yǎng)液。(4)完整渦蟲處理 2d , 渦蟲再生 1d、4d、7d, 10d，分組測定 SOD,CAT 酶活。常用測定方法有 Lowry 法和考馬斯亮藍G250 染料結(jié)合法。故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。取六只試管中按表 21 配制 0100μg/ml 牛血清蛋白液各 1ml。總蛋白含量（mg/ml）=m/v（公式 21） ，式中m：查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg） ；v：測定所取提取液體積（ml）試管號 1 2 3 4待測樣品液（ml ）0 蒸餾水（ml） 考馬斯亮藍 G250（ml）4 4 4 4表 22 樣品蛋白的測定 CAT 酶活力測定 實驗原理H2O2在 240nm 波長下有強吸收。(2) 取 10ml 試管 4 支，3 支為測定（3 個重復(fù)） ，1 支為對照，按下表加入試劑。CAT 活性（U/ml）=△A 240/(T V)（公式 22）式中△A 240=A（A1+A2+A3）/3（公式 23） ，A 為對照管吸光度，A1，A2，A3 為樣品測定管與對照管吸光度的差值； T 為測定時間（min） ，V為測定所取提取液體積（ml） 。實驗表明，其自氧化率隨溶液的 pH、溫度的升高而增大，在實際操作中，一般 pH 為 ~，鄰苯三酚濃度為 ~，溫度為 25℃ [41]。樣品管測定時先加入預(yù)熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。組間差異用單因素方差分析(Oneway ANOVA) ，最小顯著差數(shù)法 LSD檢驗進行兩兩比較.，檢驗水準(zhǔn)取α = 。得線性方程為：y=,R2=。CAT比活（U/mg）CAT濃度 未切 2天 再生 1天 再生 4天 再生 7天 再生 10天0mg/l 177。0.0213177。393177。0.0592177。0.1488177。022mg/l177。0.1528177。0.1105177。0.0191177。 圖 32 再生不同天數(shù) CAT 酶活隨 SDS 濃度變化趨勢由圖 32 可以看出，不同再生天數(shù)內(nèi) CAT 酶活隨 SDS 濃度的增加均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，隨后趨于穩(wěn)定。再生 1 天時，小濃度與對照組無顯著性差異(P)，與 0mg/l 相比， 1mg/l 的 SDS 對 CAT 活性無顯著的增效作用， ，但是在 (P)，最適濃度為2mg/l。再生 10 天時,小濃度的 SDS 對 CAT 酶活有沒顯著的增效作用（P)，即 、1mg/l 與對照組沒有顯著性差異，、2mg/l 、3mg/l與對照組有極顯著性差異。但隨著作用天數(shù)的增加，CAT 耐受 SDS 濃度降低。消耗大量的氧，氧損傷程度增加，活性氧增多，促進了抗氧化酶—CAT 的合成。CAT 酶活隨天數(shù)的增加呈下降趨勢。7 天和 10 天的變化范圍又開始減小，趨于穩(wěn)定。 SOD 酶活測定 SOD 酶活測定數(shù)值S0D比活（U/mg）SDS濃度 未切 2天 再生 1天 再生 4天 再生 7天 再生 10天0177。1.209177。8177。177。177。1.7552mg/l177。2.490177。52177。1.326177。標(biāo)準(zhǔn)差表示，最終計算結(jié)果如表34所示。組間差異用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，有顯著差異者用 Tukey HSD 檢驗進行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)取 α = 和 α = 。再生 1 天時，（P）,其余所有濃度的 SDS 對 SOD 酶活均有極顯著性影響(P),SOD 酶活性比對照組極顯著增加；，1mg/l，（p） 。再生 7 天時，各個濃度的 SDS 與對照組 0mg/l 相比，對 SOD 酶活都有極顯著差異（P),SOD 酶活性極顯著增強。再生 10 天時，各濃度變化曲線與未切處理兩天的對照組極其相似，(P)。 SOD 的最適 SDS 濃度也隨天數(shù)的增加而降低。解釋：SOD 在 1 天,4 天,7 天這幾天酶活性因為細(xì)胞的快速再生，酶活性大大增加。這與 Dimitrova 等于1994 年提出的 SOD 和 CAT 是氧損害的第一道防線，二者能對外源物產(chǎn)生協(xié)同反應(yīng)的結(jié)論一致。隨 SDS 濃度增加，CAT 隨再生天數(shù)變化趨勢加快，都高于對照組。由于 SDS 有促進細(xì)胞氧化應(yīng)激性的能力，因此加快了 SOD 的變化趨勢。實驗 SDS 濃度范圍內(nèi)（≤3mg/L ） ，提高濃度 SOD 酶活不再變化，而 CAT酶活上升后又很快下降。SDS 對 CAT有低濃度促進，高濃度抑制的作用。SOD 的最適 SDS濃度也隨天數(shù)的增加而降低。不同濃度的 SDS對渦蟲再生過程中的 SOD酶活變化速度有增效作用。SOD是再生中發(fā)揮主要作用的抗氧化酶。再生后期再生完成細(xì)胞分裂、分化程度降低， ，氧損傷減小，SOD 酶活降低，恢復(fù)到正常水平，所以與對照組酶活性變化相似。（6）SDS 處理的渦蟲再生的前幾天，酶活性增高，可能是由于細(xì)胞分裂和分化，耗氧量大增，氧損傷程度增加，活性氧含量升高，從而促進了抗氧化酶—SOD酶活升高。(4)濃度為 。SDS 對 SOD呈現(xiàn)低濃度促進，高濃度抑制的作用。不同濃度的SDS對渦蟲再生過程中的 CAT酶活變化速度有增效作用。結(jié) 論(1) CAT 對 SDS有一定的緩沖能力。而且 SOD的在再生過程中的變化趨勢要快于 CAT，可見雖然 SOD 是渦蟲再生過程中的主要發(fā)揮抗氧化作用的酶，這符合學(xué)術(shù)界公認(rèn)的 SOD 是機體抗氧化的第一道防線的觀點。圖 35 不同 SDS 濃度下 SOD 酶活隨再生天數(shù)變化 （0 代表未切兩天處理）解釋：完整渦蟲身體表面完整，沒有損傷，在 SDS 溶液中受到的脅迫作用較小，所以酶活性變化比較小。 不同 SDS 濃度下 SOD 酶活隨再生天數(shù)變化由表 34 所測數(shù)據(jù)，以渦蟲再生天數(shù)為自變量，SOD 比活為因變量，用excel2022 處理可得圖 35。說明渦蟲再生完全和 SDS 對渦蟲影響變得遲鈍。 SDS 對 SOD 呈現(xiàn)低濃度促進，高濃度抑制的作用。在低濃度范圍，SDS 酶活增加緩慢，當(dāng)在，開始緩慢降低?？梢?， SDS 濃度對 SOD 酶活性有明顯影響，當(dāng)達到 2mg/l 之后開始變得平穩(wěn)，對酶活影響大幅不再變化。再生 4 天時，除 2mg/l 的濃度外，其余各濃度與對照組相比，對 SOD 酶活無顯著影響（P） ，（P） ；2mg/l 的 SDS 與對照組相比對 SOD 酶活有極顯著差異（p） ，SDS 對 SOD的最適濃度為 2mg/l。01mg/l 酶活幾乎沒有變化，小濃度的 SDS 對其沒有影響。由圖 34， SOD酶活隨 SDS濃度的增加，的渦蟲酶活性變化比較緩慢，再生 1天的酶活最大，再生七天的酶活變化最大，再生 4天的酶活變化平穩(wěn)，再生 10天時 SOD酶活跟未切渦蟲的酶活性變化非常接近。1.001177。0.1483mg/l177。177。177。9177。1.904177。0.7861mg/l177。177。177。渦蟲再生初期即 1~4 天，由于渦蟲身體損傷，需要進行軀體重建，主要是細(xì)胞分裂和分化，耗氧量大增，氧化損傷程度增加，活性氧含量升高，從而促進了抗氧化酶—CAT 酶活升高，對不同濃度的 SDS 反應(yīng)比表劇烈，再生后期細(xì)胞分裂分化程度降低，氧損傷減小，CAT 酶活降低，再生完成，CAT酶活恢復(fù)到正常水平。處理天數(shù)不同最高峰的濃度也不同，2 天對照是 0mg/l,1 天是 2mg/l，10 天的都是。 不同 SDS 濃度下 CAT 酶活隨再生天數(shù)變化由表 32 所測數(shù)據(jù)，以渦蟲再生天數(shù)為自變量，CAT 比活為因變量，用excel2022 處理可得圖 33。綜合各組再生的情況，SDS 對 CAT 的最適濃度為。最適 SDS 濃度為 。再生 7 天時,與 0mg/l 相比，各濃度的 SDS 對 CAT 酶活都有極顯著的增效作用（P) ，1mg/l，2mg/l， ，3mg/l 沒有顯著性差異。組間差異用單因素方差分析(Oneway ANOVA) ，有顯著差異者用 Tukey HSD檢驗進行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)取α = 。0.1277177。263mg/l177。0.1501177。0.1029177。0.0919177。0.1353177。131mg/l177。0.0364177。0.1396177。標(biāo)準(zhǔn)差 表示。 第三章 結(jié)果與討論 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，配置 1~100ug/ml 的溶液，測得在 595nm 的OD 值如表 31 所示。 結(jié)果計算 定義：以每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達 50％時的酶量為