【文章內(nèi)容簡介】 （）。結(jié)合的部分肽有多種蛋白酶的切割位點(diǎn)。通過末端固定熒光標(biāo)記肽在金納米粒子的表面，一旦納米探針被制作，引入蛋白酶，結(jié)合的部分肽的殘基發(fā)生酶裂解，作為蛋白酶特異性基質(zhì)識別的一個結(jié)果，以強(qiáng)的熒光信號恢復(fù)形式顯現(xiàn)出來。該方法對蛋白酶的活性進(jìn)行了一個靈敏和快速的評估。這個方法的“addmixmeasure”格式消除了冗長的納米探針加工，極大的減少了檢測時(shí)間，使它更有普遍性。此外，此法可用于檢測生物介質(zhì)中的蛋白酶活性。對于工業(yè)常規(guī)測試，臨床檢測及高通量篩選蛋白酶抑制劑是理想的檢測方法。 多個蛋白酶檢測原理圖Fig. Cartoon illustrating the assay for multiple proteinases (trypsin, chymotrypsin, proteinase K and thermolysin) using the same AuNPspeptide?uorophore conjugates.細(xì)胞周期蛋白A2是癌癥早期階段的一個預(yù)知的標(biāo)示物。然而，由于大多數(shù)肽與蛋白結(jié)合不容易產(chǎn)生一個測量的輸出信號，這嚴(yán)重的阻礙了使用肽作為檢測探針對蛋白的均相檢測。使用對于特異性細(xì)胞周期蛋白A2結(jié)合基序的一個眾所周知的p21(WAF1)共識序列，通過在CMB的N端化學(xué)修飾，納入一個Tb3+螯合大環(huán)?；诖?，曲曉剛[53]研究小組建立了一個簡單，超靈敏和高選擇性的信號放大熒光檢測細(xì)胞周期蛋白A2（）。氧化石墨烯對于細(xì)胞周期蛋白A2的檢測優(yōu)于單壁碳納米管（SWNTs）。，比使用SWNTs的好10倍，比最近報(bào)道的使用Tb3+螯合大環(huán)修飾p21(WAF1)肽的檢測限（）好1200倍。肽與蛋白相互作用在生物學(xué)中有極其重要的作用。在研究分子識別，篩選藥物以及設(shè)計(jì)生物傳感器中，監(jiān)測肽與蛋白相互作用是至關(guān)重要的。楊黃浩[54]等采用了一種熒光方法監(jiān)測肽與蛋白相互作用，基于芘標(biāo)記肽和氧化石墨烯（GO）的組裝（）。芘標(biāo)記肽通過ππ相互作用和疏水作用牢牢的吸附在氧化石墨烯表面。結(jié)果，氧化石墨烯接近部分芘有效地猝滅了芘的熒光。存在目標(biāo)蛋白時(shí)，目標(biāo)蛋白和氧化石墨烯對肽的競爭結(jié)合導(dǎo)致了芘熒光信號的恢復(fù)。此信號機(jī)制使均相實(shí)時(shí)檢測肽與蛋白相互作用成為可能?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是血液中一個非常重要的生物標(biāo)示物。目前，由于血液樣品基質(zhì)的高度復(fù)雜性，直接在血液樣品中靈敏和選擇性的檢測MMP2仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的工作。劉志宏[55]等報(bào)道了一個均相檢測MMP2的生物傳感器，基于由上轉(zhuǎn)換熒光粉（UCPs）到碳納米粒子（CNPs）的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），設(shè)計(jì)了一個聚肽鏈（NH2GHHYYGPLGVRGCCOOH），它由特異性MMP2基質(zhì)區(qū)域（PLGVR）和一個富含π的基序（HHYY）組成，并且連接到UCPs表面的C端。通過肽和CNPs之間的ππ相互作用開始了FRET過程，因此 均相檢測細(xì)胞周期蛋白A2原理圖 Schematic illustration for the homogeneous assay for cyclin A2 by using preferential quenching of ?uorescence from unbound P1 by GO. It should be noted that the illustration is only a graphic presentation and does not represent the scale of each ponent and the precise way that P1 binds onto GO. 使用芘標(biāo)記肽和氧化石墨烯監(jiān)測蛋白肽相互作用原理圖Fig. Schematic illustration of the concept of using pyrenelabeled peptide and GO to monitor proteinpeptide interactions猝滅了供體的熒光。緊接著通過蛋白酶作用，基質(zhì)在甘氨酸和纈氨酸之間的酰胺鍵處分裂，供體和受體分開，而富含π的基序（HHYY）繼續(xù)停留在受體上。結(jié)果，供體的熒光恢復(fù)（）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在水溶液中熒光的恢復(fù)程度與MMP2的濃度在10?500 pg/mL范圍內(nèi)是成比例的。該傳感器的定量限比其它報(bào)道檢測MMP2的低至少一個數(shù)量級，可直接在人類血漿和全血樣品中檢測MMP2，得到了滿意的結(jié)果。 Schematic illustration (not to scale) of the MMP2 biosensor based on FRET from peptidelinked UCPs to CNPs 電化學(xué)方法電化學(xué)方法主要以電位、電流、電量或電導(dǎo)等電化學(xué)參數(shù)作為考察的對象，來研究溶液中被測物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化。該方法的檢測具有高的靈敏度、易實(shí)現(xiàn)自動化及連續(xù)分析等優(yōu)點(diǎn)，可用于研究分子間的相互作用，了解相互作用過程中電子的轉(zhuǎn)移機(jī)理及指示分子間作用力的大小。近年來，基于肽檢測蛋白、病毒等的電化學(xué)傳感器的研究取得了很大的進(jìn)展。Mendoza[56]設(shè)計(jì)了一種簡單的安培免疫傳感器裝置，用于檢測血清抗瓜氨酸肽抗體（ACPAs）（），它特異性于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）自身免疫疾病。RA病人的血清中包含不同瓜氨酸肽和蛋白（如纖維蛋白或者絲聚蛋白）的抗體?；诖?，使用一個嵌合的纖維蛋白絲聚蛋白合成肽（CFFCP1）作為識別元件固定在基于電化學(xué)傳感器多壁碳納米管聚苯乙烯（MWCNTPS）上。從相應(yīng)的脈沖電流響應(yīng)的重復(fù)性和再生性詳細(xì)的描述了傳感器的制作過程和它成功的電化學(xué)性能。該免疫傳感方法最初是在家兔血清中進(jìn)行，測試之前接種了合成肽，最終應(yīng)用于人類血清中ACPAs的檢測。通過與捐贈者的對照血清進(jìn)行對比，該免疫傳感器用于檢測存在于RA病人血清中的抗CFFCP1抗體具有高選擇性和高靈敏度。 多壁碳納米管表面免疫檢測原理圖 Scheme showing the immunoassay protocol on the MWCNT surface. Chimeric ?brin–?laggrin synthetic peptide bound to the carboxylic groups of the MWCNT interacts with a RA autoantibody, which is detected by interaction with an antihuman antibody conjugated to peroxidase and further enzymatic reaction with TMB substrate.Piro[57]等報(bào)道了一種無試劑的電化學(xué)肽生物傳感器，使用一個共軛聚合物聚(5羥基1，4萘醌并5羥基2羧乙基1，4萘醌)作為固定層和信號轉(zhuǎn)換元件，用于檢測人類乳頭瘤病毒（HPV）感染。該傳感器能夠檢測來自于HPV16殼蛋白的抗原肽L1和相關(guān)抗體的相互作用。朱本占[58]等建立了一種簡單和靈敏的電化學(xué)生物傳感器用于檢測通過費(fèi)頓反應(yīng)（Fe2+/H2O2）產(chǎn)生的氫氧自由基誘導(dǎo)的酪氨酸氧化。固定聚（谷氨酸，酪氨酸）（4：1）肽在氧化銦錫（ITO）電極表面，通過層層組裝技術(shù)，利用鋨聯(lián)吡啶介導(dǎo)的酪氨酸氧化電流作為生物傳感器的信號輸出者（）。研究發(fā)現(xiàn)，肽與費(fèi)頓試劑孵育之后，肽的電化學(xué)信號顯著降低。有趣的是，酪氨酸的氧化產(chǎn)物L(fēng)二羥基苯丙氨酸可能和三價(jià)鐵形成復(fù)合物，這將抑制L二羥基苯丙氨酸的電化學(xué)氧化，導(dǎo)致響應(yīng)電流的減少。該結(jié)果表明肽的破壞包含兩步，是一個二級反應(yīng)。（主語）使用X射線光電子能譜定量測定了肽附著的電極表面氮元素的百分比，消除了由肽主鏈分裂引起的信號降低的可能性。此外，檢測費(fèi)頓試劑的最低濃度為10μM Fe2+或者H2O2，與活體水平相似。 層層自組裝肽生物傳感器表面示意圖 Schematic diagram of layerbylayer assembled peptide sensor surface.曲曉剛[59]研究小組采用了一種無標(biāo)記電化學(xué)阻抗法在癌細(xì)胞中檢測周期蛋白A2，具有極高的靈敏度和選擇性，通過利用卟啉（既能引進(jìn)更多的羧基連接肽，又不會影響石墨烯的傳導(dǎo)性能）非共價(jià)功能化的石墨烯修飾玻碳電極，將一個特異性六勝肽P0 (RWIMYF)作為檢測探針，吐溫20降低非特異性吸附。 基于卟啉非共價(jià)功能化的石墨烯肽傳感器檢測周期蛋白A2示意圖 Schematic illustration of the porphyrin noncovalently functionalized graphenebased peptide sensor for cyclin A2 detection.Mahmoud[60]等采用了一種快速和簡單的電化學(xué)檢測方法，檢測人類免疫缺陷病毒（HIV）病人血清中蛋白酶（HIV1 PR）的存在。在一次性絲網(wǎng)印刷金電極（SPGE）表面修飾金納米粒子（AuNPs）或者巰基化的單臂碳納米管/金納米粒子（SWCNT/AuNPs），隨后將巰基端二茂鐵抑胃酶肽自組裝在修飾過的電極表面。通過掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）確認(rèn)了二茂鐵胃酶抑制劑與HIV1 PR之間的相互作用，利用微分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行檢測。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰電位的移動與人類免疫缺陷病毒感染血清樣品中HIV1病毒復(fù)制數(shù)量的增加成線性關(guān)系。 電化學(xué)發(fā)光分析法 電化學(xué)發(fā)光分析法概述電化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法，也稱電致化學(xué)發(fā)光，是由電化學(xué)方法引發(fā)的化學(xué)發(fā)光。與化學(xué)發(fā)光相類似，ECL不需要使用外部光源?；瘜W(xué)發(fā)光和電化學(xué)巧妙的結(jié)合在一起，使ECL具有許多潛在的優(yōu)勢。首先，一些反應(yīng)物可在電極表面電化學(xué)再生。這些反應(yīng)物的再生使他們再次參與ECL反應(yīng)，過量的共反應(yīng)物和ECL發(fā)光體反應(yīng)產(chǎn)生光，每個測量周期產(chǎn)生許多光子，極大地增強(qiáng)了該方法的靈敏度。例如，此法能高靈敏地檢測亞皮摩爾濃度的釕聯(lián)吡啶（Ru(bpy)32+），線性范圍可達(dá)到大于六個數(shù)量級之寬。反應(yīng)物的再生也能發(fā)展發(fā)光器件，簡化儀器，節(jié)約試劑。第二，極不穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光試劑和中間體能在原位被電致，需要極不穩(wěn)定試劑的化學(xué)發(fā)光分析，可以很容易的進(jìn)行ECL分析。因此，ECL也能避免在一些化學(xué)發(fā)光體系中不穩(wěn)定試劑的問題，包括一些重要的體系，如Ru(bpy)32+ ECL和魯米諾ECL。第三，它有可能電化學(xué)活化一些化合物成為能參與一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的物種，因此擴(kuò)展了一個特定化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可檢測分析物的范圍。第四，由于ECL發(fā)射接近電極表面，這就使我們能夠較大程度的控制發(fā)射的位置，這將有利于提高檢測物的靈敏度、選擇性，進(jìn)行多分析物檢測和成像分析。例如，通過ECL結(jié)合磁珠技術(shù)進(jìn)行無分離分析，結(jié)合和未結(jié)合部分ECL信號有顯著的差異?？刂莆恢靡材茉谙嗤臉悠分惺褂枚鄠€電極檢測多個分析物，以及發(fā)展ECL顯微鏡學(xué)。第五，它允許對ECL反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行較大的控制，從而提高了再現(xiàn)性，簡化操作。第六，同時(shí)獲得電流信號和光信號，通過電化學(xué)方法促進(jìn)了光發(fā)射機(jī)制的研究，電化學(xué)反應(yīng)的研究通過ECL以及ECL和電化學(xué)的同時(shí)檢測。此外，ECL在某些情況下是相對良性和友好的，因?yàn)樗嗽谝恍┗瘜W(xué)發(fā)光體系中有毒和/或腐蝕性試劑的使用，包括普及的Ru(bpy)32+體系。另一方面，在ECL中需要的電化學(xué)技術(shù)在分析應(yīng)用中產(chǎn)生了一些局限性。例如，ECL需要一種電化學(xué)設(shè)置和電極表面的頻繁更新，以確保良好的再現(xiàn)性。一般的ECL發(fā)生在電極表面附近。因此，它比化學(xué)發(fā)光弱得多，且對光探測器的靈敏度有更高的要求。在20世紀(jì)60年代中期，人們報(bào)道了涉及有機(jī)化合物ECL發(fā)射的第一個詳細(xì)的研究，但是報(bào)道關(guān)于電解過程中光發(fā)射的日期追溯至20年代。Ru(bpy)32+和它的類似物的ECL研究始于20世紀(jì)70年代。然而，70年代ECL的分析應(yīng)用在文獻(xiàn)中零星的出現(xiàn)，直到80年代才大量出現(xiàn)。在接下來的二十年中，ECL發(fā)展迅速，已成為一個非常強(qiáng)大的技術(shù)。商業(yè)ECL免疫分析和DNA探針檢測已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品和水質(zhì)檢測、環(huán)境監(jiān)測、生物戰(zhàn)劑檢測、科研等領(lǐng)域。利用電化學(xué)發(fā)光可以檢測許多分析物，特別是含有氨的分析物，通過結(jié)合高效液相色譜（HPLC）、流動注射分析（FIA）、毛細(xì)管電泳（CE）和微觀全面分析體系(μTAS)，出現(xiàn)了一些新的電化學(xué)發(fā)光體系，使ECL的應(yīng)用范圍更廣。產(chǎn)生ECL有兩個主要的路徑，湮滅和共反應(yīng)物路徑。在湮滅路徑中，通過電位階躍或者掃描氧化和還原物都產(chǎn)生在電極表面，這些物質(zhì)通過相互作用產(chǎn)生一個基態(tài)和一個電子激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)通過發(fā)射松弛。湮滅ECL機(jī)理通常由如下（方程（1）（6））表示，這里的1A* 和3A*各自代表單重態(tài)物種和三重態(tài)物種。當(dāng)體系有足夠的能量時(shí)，發(fā)光過程被定義為按照單線路徑“S路徑”（方程（1） （3）），因?yàn)?A*將直接產(chǎn)生。基于芳香族化合物的大部分ECL體系都屬于這種機(jī)制。相比之下，在沒有足夠能量的體系中，三重態(tài)能量3A *將首先產(chǎn)生，之后通過3A *隨后的湮沒產(chǎn)生1A *（三重三重湮沒），這種反應(yīng)據(jù)說按照“T路徑”（方程（4）（6））。在共反應(yīng)物路徑中，發(fā)光體和共反應(yīng)物都存在時(shí)，通過在電極上一個定向的電位掃描產(chǎn)生ECL。例如，草酸根離子（C2O42）是發(fā)現(xiàn)的第一個共反應(yīng)物。Ru(bpy)32+/草酸體系的ECL如下（方程（7）（13））產(chǎn)生。該體系中一個非常有趣的現(xiàn)象是草酸的氧化導(dǎo)致了一個強(qiáng)還原性介質(zhì)CO2?的產(chǎn)生，而不是一個氧化性介質(zhì)。通過電化學(xué)氧化產(chǎn)生還原性介質(zhì)的ECL體系被稱為“氧化還原”ECL體系。另一個“氧化還原”體系的例子是常見的Ru(bpy)32+/三丙胺（TPrA）體系，目前是商業(yè)ECL免疫分析和DNA分析的基礎(chǔ)。該體系的機(jī)制近些年已被詳細(xì)的闡述。，有四個可能的反應(yīng)路徑。在Scheme 1中，ECL反應(yīng)發(fā)生如下（方程（14）（18））。Ru(bpy)32+和TPrA在電極表面均被氧化，通過TPrA?還原Ru(bpy)33+產(chǎn)生激發(fā)態(tài)。在Sch