【正文】 能氧化TPrA，不足以氧化Ru(bpy)32+，稱為L(zhǎng)OP電化學(xué)發(fā)光。在Scheme 3中，僅僅Ru(bpy)33+在電極表面產(chǎn)生，產(chǎn)生的Ru(bpy)33+氧化TPrA。有四個(gè)可能的反應(yīng)路徑。該體系中一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是草酸的氧化導(dǎo)致了一個(gè)強(qiáng)還原性介質(zhì)CO2?的產(chǎn)生，而不是一個(gè)氧化性介質(zhì)。相比之下，在沒(méi)有足夠能量的體系中，三重態(tài)能量3A *將首先產(chǎn)生，之后通過(guò)3A *隨后的湮沒(méi)產(chǎn)生1A *（三重三重湮沒(méi)），這種反應(yīng)據(jù)說(shuō)按照“T路徑”（方程（4）（6））。在湮滅路徑中，通過(guò)電位階躍或者掃描氧化和還原物都產(chǎn)生在電極表面，這些物質(zhì)通過(guò)相互作用產(chǎn)生一個(gè)基態(tài)和一個(gè)電子激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)通過(guò)發(fā)射松弛。在接下來(lái)的二十年中，ECL發(fā)展迅速，已成為一個(gè)非常強(qiáng)大的技術(shù)。因此，它比化學(xué)發(fā)光弱得多，且對(duì)光探測(cè)器的靈敏度有更高的要求。此外，ECL在某些情況下是相對(duì)良性和友好的，因?yàn)樗嗽谝恍┗瘜W(xué)發(fā)光體系中有毒和/或腐蝕性試劑的使用，包括普及的Ru(bpy)32+體系。例如，通過(guò)ECL結(jié)合磁珠技術(shù)進(jìn)行無(wú)分離分析，結(jié)合和未結(jié)合部分ECL信號(hào)有顯著的差異。第二，極不穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光試劑和中間體能在原位被電致，需要極不穩(wěn)定試劑的化學(xué)發(fā)光分析，可以很容易的進(jìn)行ECL分析。首先，一些反應(yīng)物可在電極表面電化學(xué)再生。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰電位的移動(dòng)與人類免疫缺陷病毒感染血清樣品中HIV1病毒復(fù)制數(shù)量的增加成線性關(guān)系。 層層自組裝肽生物傳感器表面示意圖 Schematic diagram of layerbylayer assembled peptide sensor surface.曲曉剛[59]研究小組采用了一種無(wú)標(biāo)記電化學(xué)阻抗法在癌細(xì)胞中檢測(cè)周期蛋白A2，具有極高的靈敏度和選擇性，通過(guò)利用卟啉（既能引進(jìn)更多的羧基連接肽，又不會(huì)影響石墨烯的傳導(dǎo)性能）非共價(jià)功能化的石墨烯修飾玻碳電極，將一個(gè)特異性六勝肽P0 (RWIMYF)作為檢測(cè)探針，吐溫20降低非特異性吸附。有趣的是，酪氨酸的氧化產(chǎn)物L(fēng)二羥基苯丙氨酸可能和三價(jià)鐵形成復(fù)合物，這將抑制L二羥基苯丙氨酸的電化學(xué)氧化，導(dǎo)致響應(yīng)電流的減少。該傳感器能夠檢測(cè)來(lái)自于HPV16殼蛋白的抗原肽L1和相關(guān)抗體的相互作用。從相應(yīng)的脈沖電流響應(yīng)的重復(fù)性和再生性詳細(xì)的描述了傳感器的制作過(guò)程和它成功的電化學(xué)性能。近年來(lái)，基于肽檢測(cè)蛋白、病毒等的電化學(xué)傳感器的研究取得了很大的進(jìn)展。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在水溶液中熒光的恢復(fù)程度與MMP2的濃度在10?500 pg/mL范圍內(nèi)是成比例的。劉志宏[55]等報(bào)道了一個(gè)均相檢測(cè)MMP2的生物傳感器，基于由上轉(zhuǎn)換熒光粉（UCPs）到碳納米粒子（CNPs）的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），設(shè)計(jì)了一個(gè)聚肽鏈（NH2GHHYYGPLGVRGCCOOH），它由特異性MMP2基質(zhì)區(qū)域（PLGVR）和一個(gè)富含π的基序（HHYY）組成，并且連接到UCPs表面的C端。存在目標(biāo)蛋白時(shí)，目標(biāo)蛋白和氧化石墨烯對(duì)肽的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合導(dǎo)致了芘熒光信號(hào)的恢復(fù)。在研究分子識(shí)別，篩選藥物以及設(shè)計(jì)生物傳感器中，監(jiān)測(cè)肽與蛋白相互作用是至關(guān)重要的。基于此，曲曉剛[53]研究小組建立了一個(gè)簡(jiǎn)單，超靈敏和高選擇性的信號(hào)放大熒光檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白A2（）。對(duì)于工業(yè)常規(guī)測(cè)試，臨床檢測(cè)及高通量篩選蛋白酶抑制劑是理想的檢測(cè)方法。通過(guò)末端固定熒光標(biāo)記肽在金納米粒子的表面，一旦納米探針被制作，引入蛋白酶，結(jié)合的部分肽的殘基發(fā)生酶裂解，作為蛋白酶特異性基質(zhì)識(shí)別的一個(gè)結(jié)果，以強(qiáng)的熒光信號(hào)恢復(fù)形式顯現(xiàn)出來(lái)。大量生物模擬，基于肽的傳感系統(tǒng)已在近年來(lái)的文獻(xiàn)中報(bào)道，檢測(cè)方法大多為熒光和電化學(xué)方法。嗅覺(jué)受體蛋白作為一個(gè)例子已經(jīng)進(jìn)行了重要的研究[50]。這顯然是隨機(jī)噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，成本低，易于標(biāo)準(zhǔn)化。選定一個(gè)噬菌體展示肽庫(kù)對(duì)同一受體的兩種形式，產(chǎn)生了兩種不同的粘合劑肽，能夠區(qū)分不同的構(gòu)象。通過(guò)連接在石英晶體微天平（QCM）上的鄰近肽分子在多價(jià)乳膠（聚苯乙烯）珠上的再生使肽被更好的利用。為了允許固定，TNT的甲基被一個(gè)苯磺酸基取代，適用于通過(guò)磺酰胺鍵的形成共價(jià)連接載體蛋白。生物素常常被發(fā)現(xiàn)在連接器端，允許固定在抗生物素蛋白涂層的表面。在噬菌體上的融合表達(dá)蛋白和目標(biāo)物的固定體系均能影響結(jié)合事件。噬菌體展示外源基因插入一個(gè)噬菌體外殼蛋白基因，所需的氨基酸序列與內(nèi)源基因融合，產(chǎn)生一個(gè)雜交融合蛋白。然而，穩(wěn)定的支架一般大，難以大量合成或表達(dá)。主要缺點(diǎn)在于全人工設(shè)計(jì)肽的理論方法這個(gè)巨大的困難仍然需要克服。 萬(wàn)古毒素的結(jié)合模型Fig. Model of binding of vanycin to stable, wellpacked, and mixed SAMs presenting DAlaDAla (blue sticks). The mixed SAMs are linked by ligand 1 (a short ethylene glycol oligomer) and SAM ponent 3 (thiolipoic acid).如果在某種程度上設(shè)計(jì)肽的環(huán)區(qū)域結(jié)合目標(biāo)物，那么它的識(shí)別干擾聚集，金納米離子被轉(zhuǎn)向一個(gè)自由的形式，這與聚集的光譜特性差異很大（）。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，實(shí)時(shí)分析和樣品的無(wú)需標(biāo)記[26]。我們報(bào)道了兩個(gè)生物傳感器，利用自組裝肽作為分子識(shí)別元件，檢測(cè)肉毒素A和萬(wàn)古霉素。 PAM1, PAM2 to dimethyl amine[15]Dioxins andPCBs[N]NFQGaa[C]QCM[16]DioxinsFLDQPhenylglycineand other designedpentamersOnbead fluorescence microscopyLOD ng/mlVery detailed data on crossreactivity with chlorinated dioxins (+) PCBs (?), chlorinated dibenzofurans (+)[17]Atrazine,diuronEYYY and other4mers frombinatorial librariesSPR200 μMto1mM[27]Carbonicanhydrase42mer helix–loop–helix peptideAssembly of gold nanoparticlesLOD 10 nM, dynamic range 10–100 nMPartial crossreactivity with human albuminaa amino acid, FET fieldeffect transistor, FRET F246。HCV sequence (NS4/7)。在石英晶體微天平上進(jìn)行了各種類別的揮發(fā)性有機(jī)化合物的同時(shí)檢測(cè)和識(shí)別，微天平上附著有合成肽的一個(gè)傳感模塊，肽來(lái)自于硅片的設(shè)計(jì)和選擇，連同導(dǎo)電聚合物[14]。一個(gè)電極表面附著肽納米管，自組裝肽作為識(shí)別分子，與鉛離子結(jié)合。一個(gè)更高水平的設(shè)計(jì)體現(xiàn)在一個(gè)八肽形成聚集的納米小纖維覆蓋在電極表面，在銅結(jié)合之后構(gòu)象改變，因而修飾了電極的活性[10]。在此基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)場(chǎng)效應(yīng)晶體管選擇性對(duì)銅敏感和一個(gè)聚吡咯納米線電極[7，8]。但仍存在很多問(wèn)題，例如怎樣實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在實(shí)際樣品中的檢測(cè)，如何提高方法靈敏度和選擇性，是我們不得不面臨的重大挑戰(zhàn)。這樣的肽往往比抗體有更好的性能，但當(dāng)目標(biāo)物是小分子時(shí)它們很難選擇，因?yàn)楣潭ㄋ喈?dāng)是修改其結(jié)構(gòu)。 肽應(yīng)用于生物傳感的來(lái)源近年來(lái)根據(jù)不同的策略，建立了基于肽的傳感器。隨著醫(yī)學(xué)及生化技術(shù)的發(fā)展，肽類藥物因具有原料簡(jiǎn)單易得、藥效高、副作用低、不蓄積中毒、用途廣泛、種類繁多等優(yōu)點(diǎn)，已成為21世紀(jì)重要的診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)防和治療藥物。近幾十年以來(lái)，肽在人體中所起的作用已逐漸引起科學(xué)界的高度重視。肽按其組成氨基酸的數(shù)目分為不同的種類：通常由210個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽（小分子肽）；1050個(gè)氨基酸組成的肽稱為多肽；含有50個(gè)以上氨基酸殘基的肽衍生物則被歸類于蛋白質(zhì)[3]。電化學(xué)發(fā)光[2]是化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，集成了發(fā)光分析高靈敏度、線性范圍寬和電化學(xué)電位可控性、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，引起了分析化學(xué)工作者廣泛的關(guān)注。近年來(lái)，通過(guò)指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選得到的寡核苷酸肽，不僅具備類似抗體對(duì)靶分子的高親合力、高特異性、分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易合成和可進(jìn)行連接性修飾等特點(diǎn)，而且可反復(fù)使用和長(zhǎng)期保存，在疾病診斷的檢測(cè)方面受到人們的關(guān)注。以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的新型電化學(xué)發(fā)光生物傳感方法的研究畢業(yè)論文目 錄摘 要 IAbstract III第一章 引言 1 肽 2 肽的概述 2 肽應(yīng)用于生物傳感的來(lái)源 2 以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的生物分析法研究進(jìn)展 11 熒光光譜法 12 電化學(xué)方法 15 電化學(xué)發(fā)光分析法 17 電化學(xué)發(fā)光分析法概述 17 電化學(xué)發(fā)光生物分析法研究進(jìn)展 21 本論文的研究目的及意義 26第2章 以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的均相電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I 28 引言 28 實(shí)驗(yàn)部分 40 儀器與試劑 40 電化學(xué)發(fā)光探針的制備 41 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)cTnI 41 結(jié)果與討論 42 電化學(xué)發(fā)光探針的表征 42 電化學(xué)發(fā)光探針對(duì)cTnI的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng) 42 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 45 線性范圍和檢出限 46 選擇性 47 樣品分析 48 結(jié)論 49第3章 以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測(cè)活性前列腺特異性抗原 51 引言 51 實(shí)驗(yàn)部分 52 儀器與試劑 52 電化學(xué)發(fā)光探針的制備 53 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備 54 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)PSA 55 結(jié)果與討論 55 電化學(xué)發(fā)光探針的表征 55 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器對(duì)PSA的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng) 56 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 57 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器的性能 59 64 結(jié)論 65結(jié) 論 67參考文獻(xiàn) 69致 謝 87攻讀碩士期間主要研究成果 89第1章 引言第一章 引言心臟病、惡性腫瘤等疾病正在嚴(yán)重威脅著人類的生命，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，研究病源、基因和藥物以便于建立簡(jiǎn)單、特異、敏感和快速的病源、基因和藥物檢測(cè)方法，這對(duì)于早期預(yù)防、診斷和治療疾病具有極其重要的意義。DNA生物傳感器是指固定在基體表面的探針DNA分子與樣品中的靶DNA進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)，進(jìn)而獲取靶DNA的相關(guān)信息。利用噬菌體展示技術(shù)合成的肽與抗體相比，具有高的親和性，極強(qiáng)的生物活性和多樣性，且分子量小，易于改造，易于化學(xué)合成，價(jià)格低廉，可在極端條件下使用，無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，已作為分子識(shí)別物質(zhì)在生物傳感器的研制方面得到人們的廣泛關(guān)注。氨基酸的不同側(cè)鏈對(duì)肽的生化模式起著重要的作用。肽存在于生物體內(nèi)的濃度很低，血液中一般僅為1010mol/L，但其生理活性很強(qiáng)，在調(diào)節(jié)生理功能過(guò)程中起著重要的作用[4]。總之，肽涉及人體的神經(jīng)、激素、生殖和細(xì)胞生長(zhǎng)等多個(gè)領(lǐng)域，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、保健、衛(wèi)生、食品、化妝品等方面。相比于傳統(tǒng)的生物大分子，肽具有分子量小、易于改造、易于化學(xué)合成、價(jià)格低廉、可在極端條件下使用、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，已作為分子識(shí)別物質(zhì)在生物傳感器的研制方面得到人們的廣泛關(guān)注。肽是以隨機(jī)的方式從大的、不集中的、常常先前就存在以及市場(chǎng)上可買到的噬菌體展示庫(kù)中選擇，沒(méi)有設(shè)計(jì)元素。目前，肽已被利用作為活性元素來(lái)檢測(cè)自己的天然受體，抗菌劑和細(xì)胞滲透肽已用來(lái)檢測(cè)致病菌。即使是非常簡(jiǎn)單的三肽GlyGlyHis，因?yàn)殡呐c銅的選擇性相互作用，設(shè)計(jì)上體現(xiàn)了離子選擇性，然而它的同分異構(gòu)體GlyHisGly與銅和鋅能夠交叉反應(yīng)。這個(gè)結(jié)果也解釋了肽的離子選擇性， GlyHisGly同分異構(gòu)體由于空間原因可能無(wú)法形成四配位基絡(luò)合物，通過(guò)組氨酸形成的單配位基絡(luò)合物沒(méi)有選擇性。已知和鎳相互作用的肽序列（來(lái)自于破傷風(fēng)毒素（P12），C型肝炎病毒，片段（NS4/7）以及一個(gè)聚H的序列）已被用于基于微陣列的表面等離子體共振成像，對(duì)肽和金屬的相互作用或者金屬含量進(jìn)行多參數(shù)和同時(shí)分析，以便于監(jiān)測(cè)一個(gè)大型面板上金屬介導(dǎo)的生物活性[12]。小的有機(jī)分子也已通過(guò)設(shè)計(jì)的寡肽檢測(cè)。 銅在三肽附著的微懸臂上的選擇性結(jié)合Fig. Selective binding of copper to a microcantilever coated with the GlyGlyHis tripeptide. EDC NethylN(dimethylaminopropyl)carbodiimide, MPA mercaptoproprionic acid, NHS Nhydroxysuccinimide. 基于設(shè)計(jì)合成肽傳感器Table Sensors based upon designed synthetic peptidesReference TargetSensing peptideSensorSensitivitySelectivity[7]Cu2+3mer GGHSilicon nanowire FET1 nM to 1 mMCu2+ in the presence of Zn2+[8]Cu2+3mer GGHPolypyrrole nanowire electrode20–300 nM[9]Cu2+3mer GGHMicrocantilever1 μMto1mM[10]Cu2+8mer NCGAITIGIonselective electrode15–50 μM[11]Zn2+Zincfinger peptideFRET fluorimetric[12]Ni2+Tetanus toxin (P12)。 PAC1, PAC2 t