【正文】 分子識別機制是一個很好的選擇。探索具有高特異性、高穩(wěn)定性的新型生物分子識別元件，建立高選擇型、高靈敏度的生物傳感新技術(shù)是當(dāng)前分析化學(xué)研究所面臨的一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。本論文的引言部分?jǐn)M簡單介紹肽及肽的來源，著重評述以肽作為分子識別物質(zhì)的生物分析法的研究進展；同時介紹電化學(xué)發(fā)光分析法的分類并評述均相電化學(xué)發(fā)光分析法的研究進展；在此基礎(chǔ)上，提出本論文的研究目的及意義。人們通過設(shè)計基于單個或幾個氨基酸與目標(biāo)物已知的相互作用而合成的肽，獲得靈敏和復(fù)雜的傳感器。設(shè)計離子敏感肽的靈感也來自于更復(fù)雜的自然生成的基序：鋅指肽序列已被用于建立一個鋅福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光傳感器[11]。rster resonance energy transfer, HCV hepatitis C virus, LOD limit of detection, PCBs polychlorinated biphenyls, QCM quartz crystal microbalance, SPR surface plasmon resonance, SPRI surface plasmon resonance imaging, VOCs volatile organic pounds半胱氨酸氨基末端肽[18]，硫辛酰螺旋肽[19，20]以及酸末端有巰基的兩親的β肽[21]能夠在金電極表面形成自組裝單層，提供了一個有利的手段操縱金屬納米粒子的表面性能。在硅片上設(shè)計一個能夠結(jié)合選定目標(biāo)的肽需要反復(fù)地優(yōu)化目標(biāo)函數(shù)（例如，結(jié)合力），根據(jù)不同于它們主序列的候選肽庫。如果目標(biāo)物展示在抗生物素生物素表面，與連接器甚至與抗生物素蛋白的交叉反應(yīng)，往往是一個問題。原則上，對于任何一種目標(biāo)物，可以嘗試摸索出來自同一商業(yè)文庫的肽受體，然而結(jié)果是相當(dāng)難以預(yù)測的，肽的性能可能比抗體好很多[40，43]，或者也許差很遠[32，45]。 多個蛋白酶檢測原理圖Fig. Cartoon illustrating the assay for multiple proteinases (trypsin, chymotrypsin, proteinase K and thermolysin) using the same AuNPspeptide?uorophore conjugates.細胞周期蛋白A2是癌癥早期階段的一個預(yù)知的標(biāo)示物。通過肽和CNPs之間的ππ相互作用開始了FRET過程，因此 均相檢測細胞周期蛋白A2原理圖 Schematic illustration for the homogeneous assay for cyclin A2 by using preferential quenching of ?uorescence from unbound P1 by GO. It should be noted that the illustration is only a graphic presentation and does not represent the scale of each ponent and the precise way that P1 binds onto GO. 使用芘標(biāo)記肽和氧化石墨烯監(jiān)測蛋白肽相互作用原理圖Fig. Schematic illustration of the concept of using pyrenelabeled peptide and GO to monitor proteinpeptide interactions猝滅了供體的熒光。朱本占[58]等建立了一種簡單和靈敏的電化學(xué)生物傳感器用于檢測通過費頓反應(yīng)（Fe2+/H2O2）產(chǎn)生的氫氧自由基誘導(dǎo)的酪氨酸氧化。這些反應(yīng)物的再生使他們再次參與ECL反應(yīng)，過量的共反應(yīng)物和ECL發(fā)光體反應(yīng)產(chǎn)生光，每個測量周期產(chǎn)生許多光子，極大地增強了該方法的靈敏度。在20世紀(jì)60年代中期，人們報道了涉及有機化合物ECL發(fā)射的第一個詳細的研究，但是報道關(guān)于電解過程中光發(fā)射的日期追溯至20年代。通過電化學(xué)氧化產(chǎn)生還原性介質(zhì)的ECL體系被稱為“氧化還原”ECL體系。而均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析不需要洗滌、分離等步驟，因其操作簡單，可實現(xiàn)自動化等優(yōu)點受到人們的廣泛關(guān)注。通過一整夜的孵化之后，這兩個標(biāo)記分子和單抗結(jié)合，生成的免疫復(fù)合物被鏈霉親和素附著的順磁珠捕獲，用電化學(xué)發(fā)光法進行分析。該免疫傳感器具有高的靈敏度，好的特異性及穩(wěn)定性，可以成為一種有前途的技術(shù)用于腫瘤標(biāo)示物檢測。分析物凝血酶的加入引起了適體傳感器中釕復(fù)合物標(biāo)記Tgt適體的解離，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光強度顯著的降低。檢測限比報道的基于適體的交流電流伏安和光學(xué)可卡因生物傳感器的檢測限低4到6個數(shù)量級。目前已報道的檢測cTnI的方法有，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[3]，表面等離子體共振免疫傳感分析[4]，熒光免疫分析[56]，側(cè)向流動免疫分析[7]，電化學(xué)免疫分析[811]，電化學(xué)發(fā)光免疫分析[1213]等。生物檢測中最關(guān)鍵的部分可能就是分子識別元件（如抗體，適體，酶，核酸，受體等）[23]。檢測時光電倍增管(PMT)的高壓為900，除非另外的聲明。通過?；磻?yīng)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS與肽右端賴氨酸（K）上的氨基共價連接，制得電化學(xué)發(fā)光肽探針。Park已經(jīng)報道了肽和cTnI的結(jié)合[25]。109 g/mL %。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 線性范圍和檢出限在優(yōu)化的實驗條件下。Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，105 cm2/s， 107 cm2/s 及 108 cm2/s（根據(jù)斜率((2/π3/2)aD1/2計算，a是微電極的半徑)。Ru肽表現(xiàn)出了和Ru(bpy)2(dcbpy)NHS類似的電化學(xué)發(fā)光行為，進一步確定Ru(bpy)2(dcbpy)NHS已經(jīng)標(biāo)記在肽上。 實驗部分 儀器與試劑肽（FYSHSFHENWPSK， MW=），純度大于95%，廣州特立生物科技有限公司（中國）合成；心肌肌鈣蛋白I（cTnI，人類心臟）購自Abcam公司（劍橋，英國），人類甲胎蛋白（AFP）購自Fitzgerald Industries International公司（美國），人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（中國），雞蛋白蛋白購自中美生物技術(shù)有限公司（中國），其它試劑均為分析純，實驗所用溶液均用Millipore Milli Q（ WM）水配制。我們實驗室利用魯米諾和釕聯(lián)吡啶作為電化學(xué)發(fā)光信號，BSA作為載體蛋白，設(shè)計了一種檢測地高辛的均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析[21]。同時考察基于分子邏輯門的多種生物標(biāo)示物的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究。通過共價偶合包含氨基的釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru1）或者可卡因適體Ru1在一個石蠟浸漬的石墨電極上，之前電極通過電化學(xué)氧化共價修飾了4對氨基苯磺酸單層。該碳納米點萘酚納米復(fù)合膜具有高的靈敏度、好的重復(fù)性和再生性能，對于AFP的定量有一個寬的動態(tài)響應(yīng)。釕二氧化硅(釕聯(lián)吡啶摻雜二氧化硅)覆蓋的納米金(NPG)(RusilicaNPG)復(fù)合物被用來作為一個極好的標(biāo)記物，帶有放大技術(shù)。Fab分子包含了結(jié)合抗原的氨基酸序列，由一個恒定區(qū)和可變區(qū)組成，可變區(qū)包含抗體的每一個重鏈和輕鏈。Ru(bpy)32+/ TPrA體系的ECL強度極大的依賴于溶液的pH。在共反應(yīng)物路徑中，發(fā)光體和共反應(yīng)物都存在時，通過在電極上一個定向的電位掃描產(chǎn)生ECL。另一方面，在ECL中需要的電化學(xué)技術(shù)在分析應(yīng)用中產(chǎn)生了一些局限性。 電化學(xué)發(fā)光分析法 電化學(xué)發(fā)光分析法概述電化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法，也稱電致化學(xué)發(fā)光，是由電化學(xué)方法引發(fā)的化學(xué)發(fā)光。該免疫傳感方法最初是在家兔血清中進行，測試之前接種了合成肽，最終應(yīng)用于人類血清中ACPAs的檢測。此信號機制使均相實時檢測肽與蛋白相互作用成為可能。該方法對蛋白酶的活性進行了一個靈敏和快速的評估。固定生物素化的肽α/β在傳感器表面，與高或低親和力的雌性激素α相互作用，這取決于受體構(gòu)象中存在的激動劑或拮抗劑[39]。 肽噬菌體展示的循環(huán)用于結(jié)合肽的選擇Fig. The cycle of peptide phage display for the selection of binder peptides.如果目標(biāo)物是小分子，這也許就表現(xiàn)出了方法的主要缺點。使用碳酸酐酶作為一個目標(biāo)物驗證了這個概念，利用一個化學(xué)修飾肽，在肽的環(huán)上含有一個碳酸酐酶抑制劑的一部分[28]。polyH sequenceSPRI microarrayLOD 10 μM, similar to what it is usually obtained with labelfree biosensors for ions[14]VOCsShortchain polypeptides。銅被肽絡(luò)合的機制已在金微懸臂梁表面進行了直接的研究[9]，根據(jù)銅的濃度和時間產(chǎn)生不同的響應(yīng)。因此，肽類藥物的研究是目前醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中最活躍、進展最快的部分，也是21世紀(jì)最有前途的產(chǎn)業(yè)之一。但因目前篩選的適體鏈種類較少，使用范圍受到限制。 肽 肽的概述肽是由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵共價連接形成的聚合物，組成蛋白質(zhì)的20個天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成不同的肽類。但由于設(shè)計的肽在硅片設(shè)計中的應(yīng)用極為困難，此類傳感器的使用受到了很大限制。該鋅指肽在鋅結(jié)合之后構(gòu)象改變，一個熒光團/猝光劑連接在肽的末端，通過測定熒光的猝滅來檢測鋅。近來，為了仿造蛋白質(zhì)的化學(xué)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使用一個納米工程學(xué)的方法設(shè)計的肽覆蓋基質(zhì)表面，賦予一定的穩(wěn)定性[22]，極小的非特異性相互作用[23]，并且提供了一個適當(dāng)?shù)哪０逵脕斫Y(jié)合幾個分子受體或者識別官能團[23，24]。盡管這些方法已經(jīng)取得了重大成就，但計算的和實驗的蛋白設(shè)計仍然存在嚴(yán)重的技術(shù)問題。選擇肽粘合劑是相當(dāng)困難的，肽粘合劑能區(qū)分固定化和自由存在的目標(biāo)物，如先前報道的抗睪酮和抗甲氨蝶呤肽的選擇[30，31]。 基于隨機噬菌體展示肽傳感器Table Sensors based upon random phage display peptidesReferenceTargetSensing peptideSensorSensitivity[40]Murine myofibers7mer ASSLNIAAcoustic waveMurine skeletal proteins 10 μg/ml, apparent Kd 280 μg/ml Fast response (100 s), whereas a similar, antibodybased sensor shows 100min equilibration time[41]Ps. Aeruginosa wholecells9mer QRKLAAKLT resembling thesequence of natural CPPQCM[42]SW620 metastatic cells12merPotentiometric100 cells/ml blood[43]Anthrax protectiveantigen16mer HKHAHNYRLPASGGGKKSquare wave voltammetriKd pM, dynamic range 4–120 pM, LOD pM[44]Enterotoxin B12merFiber optical. The RAPTOR optical probe was used[41]Dynamic range 1031 μg/well, LOD 103 μg/well[45]Cardiac troponin I12mer FYSHSFHENWPSQCM and EISQCM: dynamic range μg/ml, LOD μg/ml EIS: LOD μg/ml[46]Streptavidin12mer from filamentous R5C2 phagesOptofluidic ring resonatorLOD 100 pM, apparent Kd 25 pM[31]Methotrexate11mer SIFPLCNSGAL selected directly on a QCM deviceQCM and SPRRange 2–50 μM, Kd μM[32]TNT12mers sharing a HR consensus dyadFluorimetric flow sensorDynamic range 6–100 mg/ml, LOD mg/ml[34]Porphyrin5mer HASYS peptide immobilized on latex beads to allow 2:1 peptidetotarget plex formationQCMDynamic range μg/ml, LOD μg/ml[39]EDCsPeptide α/β IRIFSERαLBD 100μg/mL incubated with 10 μg/mL βestradiol and with 10 μg/mL tamoxifen Discrimination between agonists and antagonists of ERαCPP cellpenetrating peptide, EDCs endocrinedisrupting chemicals, EIS electrochemical impedance spectroscopy, ERα estrogen receptor α, LBD l