【正文】 洗、分離等多個(gè)步驟。ECL強(qiáng)度的最大值大約發(fā)生在pH=，這非常適合應(yīng)用于生物體系。Scheme 4中的ECL路徑，在一個(gè)低的氧化電位（LOP）下發(fā)生，這個(gè)低的氧化電位僅僅只能氧化TPrA，不足以氧化Ru(bpy)32+，稱為L(zhǎng)OP電化學(xué)發(fā)光。在Scheme 4中，TPrA在電極上直接氧化產(chǎn)生TPrA?和TPrA?+。在Scheme 3中，僅僅Ru(bpy)33+在電極表面產(chǎn)生，產(chǎn)生的Ru(bpy)33+氧化TPrA。Ru(bpy)32+和TPrA在電極表面均被氧化，通過TPrA?還原Ru(bpy)33+產(chǎn)生激發(fā)態(tài)。有四個(gè)可能的反應(yīng)路徑。另一個(gè)“氧化還原”體系的例子是常見的Ru(bpy)32+/三丙胺（TPrA）體系，目前是商業(yè)ECL免疫分析和DNA分析的基礎(chǔ)。該體系中一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是草酸的氧化導(dǎo)致了一個(gè)強(qiáng)還原性介質(zhì)CO2?的產(chǎn)生，而不是一個(gè)氧化性介質(zhì)。例如，草酸根離子（C2O42）是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)共反應(yīng)物。相比之下，在沒有足夠能量的體系中，三重態(tài)能量3A *將首先產(chǎn)生，之后通過3A *隨后的湮沒產(chǎn)生1A *（三重三重湮沒），這種反應(yīng)據(jù)說按照“T路徑”（方程（4）（6））。當(dāng)體系有足夠的能量時(shí)，發(fā)光過程被定義為按照單線路徑“S路徑”（方程（1） （3）），因?yàn)?A*將直接產(chǎn)生。在湮滅路徑中，通過電位階躍或者掃描氧化和還原物都產(chǎn)生在電極表面，這些物質(zhì)通過相互作用產(chǎn)生一個(gè)基態(tài)和一個(gè)電子激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)通過發(fā)射松弛。利用電化學(xué)發(fā)光可以檢測(cè)許多分析物，特別是含有氨的分析物，通過結(jié)合高效液相色譜（HPLC）、流動(dòng)注射分析（FIA）、毛細(xì)管電泳（CE）和微觀全面分析體系(μTAS)，出現(xiàn)了一些新的電化學(xué)發(fā)光體系，使ECL的應(yīng)用范圍更廣。在接下來的二十年中，ECL發(fā)展迅速，已成為一個(gè)非常強(qiáng)大的技術(shù)。Ru(bpy)32+和它的類似物的ECL研究始于20世紀(jì)70年代。因此，它比化學(xué)發(fā)光弱得多，且對(duì)光探測(cè)器的靈敏度有更高的要求。例如，ECL需要一種電化學(xué)設(shè)置和電極表面的頻繁更新，以確保良好的再現(xiàn)性。此外，ECL在某些情況下是相對(duì)良性和友好的，因?yàn)樗嗽谝恍┗瘜W(xué)發(fā)光體系中有毒和/或腐蝕性試劑的使用，包括普及的Ru(bpy)32+體系。第五，它允許對(duì)ECL反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行較大的控制，從而提高了再現(xiàn)性，簡(jiǎn)化操作。例如，通過ECL結(jié)合磁珠技術(shù)進(jìn)行無分離分析，結(jié)合和未結(jié)合部分ECL信號(hào)有顯著的差異。第三，它有可能電化學(xué)活化一些化合物成為能參與一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的物種，因此擴(kuò)展了一個(gè)特定化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可檢測(cè)分析物的范圍。第二，極不穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光試劑和中間體能在原位被電致，需要極不穩(wěn)定試劑的化學(xué)發(fā)光分析，可以很容易的進(jìn)行ECL分析。例如，此法能高靈敏地檢測(cè)亞皮摩爾濃度的釕聯(lián)吡啶（Ru(bpy)32+），線性范圍可達(dá)到大于六個(gè)數(shù)量級(jí)之寬。首先，一些反應(yīng)物可在電極表面電化學(xué)再生。與化學(xué)發(fā)光相類似，ECL不需要使用外部光源。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰電位的移動(dòng)與人類免疫缺陷病毒感染血清樣品中HIV1病毒復(fù)制數(shù)量的增加成線性關(guān)系。在一次性絲網(wǎng)印刷金電極（SPGE）表面修飾金納米粒子（AuNPs）或者巰基化的單臂碳納米管/金納米粒子（SWCNT/AuNPs），隨后將巰基端二茂鐵抑胃酶肽自組裝在修飾過的電極表面。 層層自組裝肽生物傳感器表面示意圖 Schematic diagram of layerbylayer assembled peptide sensor surface.曲曉剛[59]研究小組采用了一種無標(biāo)記電化學(xué)阻抗法在癌細(xì)胞中檢測(cè)周期蛋白A2，具有極高的靈敏度和選擇性，通過利用卟啉（既能引進(jìn)更多的羧基連接肽，又不會(huì)影響石墨烯的傳導(dǎo)性能）非共價(jià)功能化的石墨烯修飾玻碳電極，將一個(gè)特異性六勝肽P0 (RWIMYF)作為檢測(cè)探針，吐溫20降低非特異性吸附。（主語(yǔ)）使用X射線光電子能譜定量測(cè)定了肽附著的電極表面氮元素的百分比，消除了由肽主鏈分裂引起的信號(hào)降低的可能性。有趣的是，酪氨酸的氧化產(chǎn)物L(fēng)二羥基苯丙氨酸可能和三價(jià)鐵形成復(fù)合物，這將抑制L二羥基苯丙氨酸的電化學(xué)氧化，導(dǎo)致響應(yīng)電流的減少。固定聚（谷氨酸，酪氨酸）（4：1）肽在氧化銦錫（ITO）電極表面，通過層層組裝技術(shù)，利用鋨聯(lián)吡啶介導(dǎo)的酪氨酸氧化電流作為生物傳感器的信號(hào)輸出者（）。該傳感器能夠檢測(cè)來自于HPV16殼蛋白的抗原肽L1和相關(guān)抗體的相互作用。通過與捐贈(zèng)者的對(duì)照血清進(jìn)行對(duì)比，該免疫傳感器用于檢測(cè)存在于RA病人血清中的抗CFFCP1抗體具有高選擇性和高靈敏度。從相應(yīng)的脈沖電流響應(yīng)的重復(fù)性和再生性詳細(xì)的描述了傳感器的制作過程和它成功的電化學(xué)性能。RA病人的血清中包含不同瓜氨酸肽和蛋白（如纖維蛋白或者絲聚蛋白）的抗體。近年來，基于肽檢測(cè)蛋白、病毒等的電化學(xué)傳感器的研究取得了很大的進(jìn)展。 Schematic illustration (not to scale) of the MMP2 biosensor based on FRET from peptidelinked UCPs to CNPs 電化學(xué)方法電化學(xué)方法主要以電位、電流、電量或電導(dǎo)等電化學(xué)參數(shù)作為考察的對(duì)象，來研究溶液中被測(cè)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在水溶液中熒光的恢復(fù)程度與MMP2的濃度在10?500 pg/mL范圍內(nèi)是成比例的。緊接著通過蛋白酶作用，基質(zhì)在甘氨酸和纈氨酸之間的酰胺鍵處分裂，供體和受體分開，而富含π的基序（HHYY）繼續(xù)停留在受體上。劉志宏[55]等報(bào)道了一個(gè)均相檢測(cè)MMP2的生物傳感器，基于由上轉(zhuǎn)換熒光粉（UCPs）到碳納米粒子（CNPs）的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），設(shè)計(jì)了一個(gè)聚肽鏈（NH2GHHYYGPLGVRGCCOOH），它由特異性MMP2基質(zhì)區(qū)域（PLGVR）和一個(gè)富含π的基序（HHYY）組成，并且連接到UCPs表面的C端?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是血液中一個(gè)非常重要的生物標(biāo)示物。存在目標(biāo)蛋白時(shí)，目標(biāo)蛋白和氧化石墨烯對(duì)肽的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合導(dǎo)致了芘熒光信號(hào)的恢復(fù)。芘標(biāo)記肽通過ππ相互作用和疏水作用牢牢的吸附在氧化石墨烯表面。在研究分子識(shí)別，篩選藥物以及設(shè)計(jì)生物傳感器中，監(jiān)測(cè)肽與蛋白相互作用是至關(guān)重要的。比使用SWNTs的好10倍，比最近報(bào)道的使用Tb3+螯合大環(huán)修飾p21(WAF1)肽的檢測(cè)限（）好1200倍?；诖?，曲曉剛[53]研究小組建立了一個(gè)簡(jiǎn)單，超靈敏和高選擇性的信號(hào)放大熒光檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白A2（）。然而，由于大多數(shù)肽與蛋白結(jié)合不容易產(chǎn)生一個(gè)測(cè)量的輸出信號(hào)，這嚴(yán)重的阻礙了使用肽作為檢測(cè)探針對(duì)蛋白的均相檢測(cè)。對(duì)于工業(yè)常規(guī)測(cè)試，臨床檢測(cè)及高通量篩選蛋白酶抑制劑是理想的檢測(cè)方法。這個(gè)方法的“addmixmeasure”格式消除了冗長(zhǎng)的納米探針加工，極大的減少了檢測(cè)時(shí)間，使它更有普遍性。通過末端固定熒光標(biāo)記肽在金納米粒子的表面，一旦納米探針被制作，引入蛋白酶，結(jié)合的部分肽的殘基發(fā)生酶裂解，作為蛋白酶特異性基質(zhì)識(shí)別的一個(gè)結(jié)果，以強(qiáng)的熒光信號(hào)恢復(fù)形式顯現(xiàn)出來。曲曉剛[52]等報(bào)道了一種均相的熒光方法用于檢測(cè)多種蛋白酶，基于一個(gè)金納米粒子肽熒光團(tuán)結(jié)合物作為基底（）。大量生物模擬，基于肽的傳感系統(tǒng)已在近年來的文獻(xiàn)中報(bào)道，檢測(cè)方法大多為熒光和電化學(xué)方法。鑒于這些原因設(shè)計(jì)了短的，基于肽的，能高特異性識(shí)別的人工受體，是生物技術(shù)的目標(biāo)之一，以獲取競(jìng)爭(zhēng)劑、抑制劑、藥物、親和純化系統(tǒng)試劑及生物傳感器中的活性元素[51]。嗅覺受體蛋白作為一個(gè)例子已經(jīng)進(jìn)行了重要的研究[50]。 基于隨機(jī)噬菌體展示肽傳感器Table Sensors based upon random phage display peptidesReferenceTargetSensing peptideSensorSensitivity[40]Murine myofibers7mer ASSLNIAAcoustic waveMurine skeletal proteins 10 μg/ml, apparent Kd 280 μg/ml Fast response (100 s), whereas a similar, antibodybased sensor shows 100min equilibration time[41]Ps. Aeruginosa wholecells9mer QRKLAAKLT resembling thesequence of natural CPPQCM[42]SW620 metastatic cells12merPotentiometric100 cells/ml blood[43]Anthrax protectiveantigen16mer HKHAHNYRLPASGGGKKSquare wave voltammetriKd pM, dynamic range 4–120 pM, LOD pM[44]Enterotoxin B12merFiber optical. The RAPTOR optical probe was used[41]Dynamic range 1031 μg/well, LOD 103 μg/well[45]Cardiac troponin I12mer FYSHSFHENWPSQCM and EISQCM: dynamic range μg/ml, LOD μg/ml EIS: LOD μg/ml[46]Streptavidin12mer from filamentous R5C2 phagesOptofluidic ring resonatorLOD 100 pM, apparent Kd 25 pM[31]Methotrexate11mer SIFPLCNSGAL selected directly on a QCM deviceQCM and SPRRange 2–50 μM, Kd μM[32]TNT12mers sharing a HR consensus dyadFluorimetric flow sensorDynamic range 6–100 mg/ml, LOD mg/ml[34]Porphyrin5mer HASYS peptide immobilized on latex beads to allow 2:1 peptidetotarget plex formationQCMDynamic range μg/ml, LOD μg/ml[39]EDCsPeptide α/β IRIFSERαLBD 100μg/mL incubated with 10 μg/mL βestradiol and with 10 μg/mL tamoxifen Discrimination between agonists and antagonists of ERαCPP cellpenetrating peptide, EDCs endocrinedisrupting chemicals, EIS electrochemical impedance spectroscopy, ERα estrogen receptor α, LBD ligand binding domain, RIFS reflectometric interference spectroscopy, TNT 2,4,6trinitrotoluene 以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的生物分析法研究進(jìn)展肽對(duì)于模仿發(fā)生在生物大分子（如酶、抗體、藥物受體）和跨膜蛋白中的分子識(shí)別機(jī)制[47–49]，是一個(gè)很好的選擇。這顯然是隨機(jī)噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，成本低，易于標(biāo)準(zhǔn)化。利用隨機(jī)噬菌體展示肽發(fā)展起來的生物傳感器系統(tǒng)的匯集如表2所示。選定一個(gè)噬菌體展示肽庫(kù)對(duì)同一受體的兩種形式，產(chǎn)生了兩種不同的粘合劑肽，能夠區(qū)分不同的構(gòu)象。非設(shè)計(jì)肽庫(kù)也許可提供能夠區(qū)分目標(biāo)物之間的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異，甚至不同構(gòu)象的肽。通過連接在石英晶體微天平（QCM）上的鄰近肽分子在多價(jià)乳膠（聚苯乙烯）珠上的再生使肽被更好的利用。然而，使用已選定肽在熒光流量傳感器中的檢測(cè)限高達(dá)12 mg/ml，最可能是由于肽無法識(shí)別未改變的、自由的TNT。為了允許固定，TNT的甲基被一個(gè)苯磺酸基取代，適用于通過磺酰胺鍵的形成共價(jià)連接載體蛋白。選擇肽粘合劑是相當(dāng)困難的，肽粘合劑能區(qū)分固定化和自由存在的目標(biāo)物，如先前報(bào)道的抗睪酮和抗甲氨蝶呤肽的選擇[30，31]。生物素常常被發(fā)現(xiàn)在連接器端，允許固定在抗生物素蛋白涂層的表面。通常在一個(gè)小的有機(jī)目標(biāo)分子（例如一種藥物）中發(fā)現(xiàn)的是極少數(shù)的官能團(tuán)，它們中的每一個(gè)也許提供一個(gè)和潛在受體的基本相互作用點(diǎn)。在噬菌體上的融合表達(dá)蛋白和目標(biāo)物的固定體系均能影響結(jié)合事件。噬菌體展示庫(kù)含有多達(dá)109個(gè)不同的噬菌體克隆元素，每個(gè)通過隨機(jī)的基因序列產(chǎn)生一個(gè)不同的肽。噬菌體展示外源基因插入一個(gè)噬菌體外殼蛋白基因，所需的氨基酸序列與內(nèi)源基因融合，產(chǎn)生一個(gè)雜交融合蛋白。在噬菌體展示肽中，其特性(如識(shí)別和結(jié)合)是與基因編碼它的基本序列相關(guān)的。然而，穩(wěn)定的支架一般大，難以大量合成或表達(dá)。盡管這些方法已經(jīng)取得了重大成就，但計(jì)算的和實(shí)驗(yàn)的蛋白設(shè)計(jì)仍然存在嚴(yán)重的技術(shù)問題。主要缺點(diǎn)在于全人工設(shè)計(jì)肽的理論方法這個(gè)巨大的困難仍然需要克服。 鋅離子促進(jìn)螺旋環(huán)螺旋的折疊允許納米粒子聚集，目標(biāo)物的識(shí)別使平衡向分散納米粒子的方向移動(dòng)Fig. Zn2+promoted folding of helix–loop–helix peptides allows nanoparticle aggregation. Recognition of the target shifts the equilibrium towards dispersed nanoparticles.設(shè)計(jì)的肽因此成為發(fā)展離子、小分子甚至蛋白傳感器的強(qiáng)大工具，并在裝置的傳感表面引進(jìn)高層次的組織