【正文】 十個假定的突變位點，那么可能的組合數(shù)將考慮為1020個。 肽噬菌體展示的循環(huán)用于結合肽的選擇Fig. The cycle of peptide phage display for the selection of binder peptides.如果目標物是小分子，這也許就表現(xiàn)出了方法的主要缺點。所有已選定的很強的粘合劑共享一個精氨酸組氨酸共識對子（一個雙配位基陽離子和一個氫鍵受體協(xié)同識別硝基）：這被認為是來自于文庫的一個正確的結合響應，同樣的，免疫系統(tǒng)和雙配位基陰離子也以非常類似的方式反應[33]。固定生物素化的肽α/β在傳感器表面，與高或低親和力的雌性激素α相互作用，這取決于受體構象中存在的激動劑或拮抗劑[39]。這些非常復雜的分子很難從自然資源中純化，也不可能合成，但它們具體應用的可用性將是十分寶貴的。該方法對蛋白酶的活性進行了一個靈敏和快速的評估。氧化石墨烯對于細胞周期蛋白A2的檢測優(yōu)于單壁碳納米管（SWNTs）。此信號機制使均相實時檢測肽與蛋白相互作用成為可能。該傳感器的定量限比其它報道檢測MMP2的低至少一個數(shù)量級，可直接在人類血漿和全血樣品中檢測MMP2，得到了滿意的結果。該免疫傳感方法最初是在家兔血清中進行，測試之前接種了合成肽，最終應用于人類血清中ACPAs的檢測。該結果表明肽的破壞包含兩步，是一個二級反應。 電化學發(fā)光分析法 電化學發(fā)光分析法概述電化學發(fā)光（ECL）分析法，也稱電致化學發(fā)光，是由電化學方法引發(fā)的化學發(fā)光。因此，ECL也能避免在一些化學發(fā)光體系中不穩(wěn)定試劑的問題，包括一些重要的體系，如Ru(bpy)32+ ECL和魯米諾ECL。另一方面，在ECL中需要的電化學技術在分析應用中產(chǎn)生了一些局限性。商業(yè)ECL免疫分析和DNA探針檢測已廣泛應用于臨床診斷、食品和水質檢測、環(huán)境監(jiān)測、生物戰(zhàn)劑檢測、科研等領域。在共反應物路徑中，發(fā)光體和共反應物都存在時，通過在電極上一個定向的電位掃描產(chǎn)生ECL。在Scheme 1中，ECL反應發(fā)生如下（方程（14）（18））。Ru(bpy)32+/ TPrA體系的ECL強度極大的依賴于溶液的pH。魯米諾BSA地高辛的免疫復合體和抗地高辛抗體結合之后的電化學發(fā)光強度比結合之前的魯米諾BSA地高辛的免疫復合體的電化學發(fā)光強度小。Fab分子包含了結合抗原的氨基酸序列，由一個恒定區(qū)和可變區(qū)組成，可變區(qū)包含抗體的每一個重鏈和輕鏈。漆紅蘭[66]等人提出了一種均相的電化學發(fā)光免疫檢測人類免疫球蛋白G（hIgG），在金納米粒子修飾的石蠟浸漬的石墨電極（PIGE）上，異魯米諾（ABEI）作為發(fā)光標記物。釕二氧化硅(釕聯(lián)吡啶摻雜二氧化硅)覆蓋的納米金(NPG)(RusilicaNPG)復合物被用來作為一個極好的標記物，帶有放大技術。隨著目標DNA濃度的增加，信號降低。該碳納米點萘酚納米復合膜具有高的靈敏度、好的重復性和再生性能，對于AFP的定量有一個寬的動態(tài)響應。該工作通過使用納米材料作為捕獲探針和信號探針的載體放大電化學發(fā)光信號，提高適體傳感器的靈敏度，是一種很有前途的方法。通過共價偶合包含氨基的釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru1）或者可卡因適體Ru1在一個石蠟浸漬的石墨電極上，之前電極通過電化學氧化共價修飾了4對氨基苯磺酸單層。電化學發(fā)光（Electrochemiluminescence，簡稱ECL），又稱電致化學發(fā)光，兼有電化學和化學發(fā)光的雙重優(yōu)點，已廣泛應用于生命科學等領域的研究中。同時考察基于分子邏輯門的多種生物標示物的電化學發(fā)光生物傳感器的研究。崔華等利用異魯米諾功能化的金納米粒子為標記物設計了一種電化學發(fā)光免疫傳感檢測人類cTnI的分析方法 [12]。我們實驗室利用魯米諾和釕聯(lián)吡啶作為電化學發(fā)光信號，BSA作為載體蛋白，設計了一種檢測地高辛的均相電化學發(fā)光免疫分析[21]。選擇cTnI作為目標蛋白，肽(FYSHSFHENWPSK)作為分子識別元件。 實驗部分 儀器與試劑肽（FYSHSFHENWPSK， MW=），純度大于95%，廣州特立生物科技有限公司（中國）合成；心肌肌鈣蛋白I（cTnI，人類心臟）購自Abcam公司（劍橋，英國），人類甲胎蛋白（AFP）購自Fitzgerald Industries International公司（美國），人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）購自北京博奧森生物技術有限公司（中國），雞蛋白蛋白購自中美生物技術有限公司（中國），其它試劑均為分析純，實驗所用溶液均用Millipore Milli Q（ WM）水配制。將標記混合物以100mM pH = PBS作為透析液，通過透析袋（截留分子量 2000）進行純化。Ru肽表現(xiàn)出了和Ru(bpy)2(dcbpy)NHS類似的電化學發(fā)光行為，進一步確定Ru(bpy)2(dcbpy)NHS已經(jīng)標記在肽上。曲線a和曲線b比較，可以看到Ru肽有一個高的電化學發(fā)光信號（a，7309），109g/mL cTnI作用之后的電化學發(fā)光信號相對較低（b，5550）。Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，105 cm2/s， 107 cm2/s 及 108 cm2/s（根據(jù)斜率((2/π3/2)aD1/2計算，a是微電極的半徑)。我們研究了Ru肽與cTnI的結合時間對電化學發(fā)光信號的影響，發(fā)現(xiàn)隨著結合時間的增加，電化學發(fā)光信號降低。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 線性范圍和檢出限在優(yōu)化的實驗條件下。電化學發(fā)光探針與cTnI作用后電化學發(fā)光值顯著降低(43%)，% (IgG)、% (BSA )、% (AFP ) 、% (雞蛋白蛋白)。109 g/mL %。這表明60min足夠使體系達到平衡。Park已經(jīng)報道了肽和cTnI的結合[25]。 (B) ECL intensitypotential profiles of 108 M Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (a) and 108 M Rupeptide (b) in M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. Scan rate, 50 mV/s.為了研究電化學發(fā)光強度降低的原因，我們利用電化學方法考察Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，Ru肽及Ru肽蛋白的擴散系數(shù)[39]。通過?；磻猂u(bpy)2(dcbpy)NHS與肽右端賴氨酸（K）上的氨基共價連接，制得電化學發(fā)光肽探針。 結果與討論 電化學發(fā)光探針的表征首先對制備的電化學發(fā)光探針（Ru肽）利用紫外可見光譜以及電化學發(fā)光技術進行表征。檢測時光電倍增管(PMT)的高壓為900，除非另外的聲明。電化學發(fā)光信號物質釕聯(lián)吡啶衍生物(Ru(bpy)2(dcbpy)NHS)標記肽(FYSHSFHENWPSK)形成Ru肽探針。生物檢測中最關鍵的部分可能就是分子識別元件（如抗體，適體，酶，核酸，受體等）[23]。均相電化學發(fā)光免疫分析法無需洗滌、分離等步驟，操作簡單，可實現(xiàn)自動化等優(yōu)點在臨床上受到人們的廣泛關注。目前已報道的檢測cTnI的方法有，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[3]，表面等離子體共振免疫傳感分析[4]，熒光免疫分析[56]，側向流動免疫分析[7]，電化學免疫分析[811]，電化學發(fā)光免疫分析[1213]等。主要展開了兩個方面的研究工作：（1）以肽為分子識別物質的均相電化學發(fā)光方法檢測心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的研究。檢測限比報道的基于適體的交流電流伏安和光學可卡因生物傳感器的檢測限低4到6個數(shù)量級。包含目標物的夾心型復合物被微磁性粒子選擇性捕獲，通過電化學發(fā)光強度定量。分析物凝血酶的加入引起了適體傳感器中釕復合物標記Tgt適體的解離，導致電化學發(fā)光強度顯著的降低。該工作研究了魯米諾在碳納米點/萘酚/玻碳電極上的相對電化學和電化學發(fā)光性能。該免疫傳感器具有高的靈敏度，好的特異性及穩(wěn)定性，可以成為一種有前途的技術用于腫瘤標示物檢測。109g/mL范圍內(nèi)成良好的線性關系，1011g/mL（S/N=3）。通過一整夜的孵化之后，這兩個標記分子和單抗結合，生成的免疫復合物被鏈霉親和素附著的順磁珠捕獲，用電化學發(fā)光法進行分析。109g/%。而均相電化學發(fā)光免疫分析不需要洗滌、分離等步驟，因其操作簡單，可實現(xiàn)自動化等優(yōu)點受到人們的廣泛關注。這個過程的好處在于總的ECL強度依賴于Ru(bpy)32+的濃度。通過電化學氧化產(chǎn)生還原性介質的ECL體系被稱為“氧化還原”ECL體系。湮滅ECL機理通常由如下（方程（1）（6））表示，這里的1A* 和3A*各自代表單重態(tài)物種和三重態(tài)物種。在20世紀60年代中期，人們報道了涉及有機化合物ECL發(fā)射的第一個詳細的研究，但是報道關于電解過程中光發(fā)射的日期追溯至20年代?？刂莆恢靡材茉谙嗤臉悠分惺褂枚鄠€電極檢測多個分析物，以及發(fā)展ECL顯微鏡學。這些反應物的再生使他們再次參與ECL反應，過量的共反應物和ECL發(fā)光體反應產(chǎn)生光，每個測量周期產(chǎn)生許多光子，極大地增強了該方法的靈敏度。 基于卟啉非共價功能化的石墨烯肽傳感器檢測周期蛋白A2示意圖 Schematic illustration of the porphyrin noncovalently functionalized graphenebased peptide sensor for cyclin A2 detection.Mahmoud[60]等采用了一種快速和簡單的電化學檢測方法，檢測人類免疫缺陷病毒（HIV）病人血清中蛋白酶（HIV1 PR）的存在。朱本占[58]等建立了一種簡單和靈敏的電化學生物傳感器用于檢測通過費頓反應（Fe2+/H2O2）產(chǎn)生的氫氧自由基誘導的酪氨酸氧化。Mendoza[56]設計了一種簡單的安培免疫傳感器裝置，用于檢測血清抗瓜氨酸肽抗體（ACPAs）（），它特異性于類風濕性關節(jié)炎（RA）自身免疫疾病。通過肽和CNPs之間的ππ相互作用開始了FRET過程，因此 均相檢測細胞周期蛋白A2原理圖 Schematic illustration for the homogeneous assay for cyclin A2 by using preferential quenching of ?uorescence from unbound P1 by GO. It should be noted that the illustration is only a graphic presentation and does not represent the scale of each ponent and the precise way that P1 binds onto GO. 使用芘標記肽和氧化石墨烯監(jiān)測蛋白肽相互作用原理圖Fig. Schematic illustration of the concept of using pyrenelabeled peptide and GO to monitor proteinpeptide interactions猝滅了供體的熒光。楊黃浩[54]等采用了一種熒光方法監(jiān)測肽與蛋白相互作用，基于芘標記肽和氧化石墨烯（GO）的組裝（）。 多個蛋白酶檢測原理圖Fig. Cartoon illustrating the assay for multiple proteinases (trypsin, chymotrypsin, proteinase K and thermolysin) using the same AuNPspeptide?uorophore conjugates.細胞周期蛋白A2是癌癥早期階段的一個預知的標示物。 熒光光譜法熒光光譜法是以物質所發(fā)射的熒光強度與濃度之間的線性關系為依據(jù)進行的定量分析，以熒光光譜的形狀和熒光峰對應的波長進行的定性分析，因其具有靈敏度高，樣品用量少，選擇性強，信息多樣，方法簡便等優(yōu)點而被廣泛應用于生物傳感領域中。原則上，對于任何一種目標物，可以嘗試摸索出來自同一商業(yè)文庫的肽受體，然而結果是相當難以預測的，肽的性能可能比抗體好很多[40，43]，或者也許差很遠[32，45]。然而，使用噬菌體展示的主要優(yōu)點在于許多粘合劑肽的產(chǎn)生來自于完全隨機文庫，都不包含任何肽結構的設計和設計結構的元素[3537]。如果目標物展示在抗生物素生物素表面，與連接器甚至與抗生物素蛋白的交叉反應，往往是一個問題。當它們從細胞中釋放時，這個雜交的外殼蛋白隨即被納入噬菌體微粒，肽被展示在病毒粒子上（）[29]。在硅片上設計一個能夠結合選定目標的肽需要反復地優(yōu)化目標函數(shù)（例如，結合力），根據(jù)不同于它們主序列的候選肽庫。一個極高水平設計的復雜肽已被用于發(fā)展JR2EC和KE2C，一對42個氨基酸的合成肽[27]。rster resonance energy transfer, HCV hepatitis C virus, LOD limit of detection, PCBs polychlorinated biphenyls, QCM quartz crystal microbalance, SPR surface plasmon resonance, SPRI surface plasmon resonance imaging, VOCs volatile organic pounds半胱氨酸氨基末端肽[18]，硫辛酰螺旋肽[19，20]以及酸末端有巰基的兩親的β肽[21]能夠在金電極表面形成自組裝單層，提供了一個有利的手段操縱金屬納米粒子的表面性能。已從組合肽庫篩選中獲得了皮克每毫升二惡英五肽粘合劑[15]，并用非天然氨基酸進行了設計修改[16]。設計離子敏感肽的靈感也來自于更復雜的自然生成的基序：鋅指肽序列已被用于建立一個鋅福斯特共振能量轉移（FRET）熒光傳感器[11]。最簡單卻最有效的肽的設計涉及到傳感器中的活性元素，這被發(fā)現(xiàn)在離子選擇性電極，如銅，鎳，鋅等金屬。人們通過設計基于單個或幾個氨基酸與目標物已知的相互作用而合成的肽，獲得靈敏和復雜的傳感器。大量的研究結果