【正文】 十個(gè)假定的突變位點(diǎn)，那么可能的組合數(shù)將考慮為1020個(gè)。 肽噬菌體展示的循環(huán)用于結(jié)合肽的選擇Fig. The cycle of peptide phage display for the selection of binder peptides.如果目標(biāo)物是小分子，這也許就表現(xiàn)出了方法的主要缺點(diǎn)。所有已選定的很強(qiáng)的粘合劑共享一個(gè)精氨酸組氨酸共識(shí)對(duì)子（一個(gè)雙配位基陽(yáng)離子和一個(gè)氫鍵受體協(xié)同識(shí)別硝基）：這被認(rèn)為是來(lái)自于文庫(kù)的一個(gè)正確的結(jié)合響應(yīng)，同樣的，免疫系統(tǒng)和雙配位基陰離子也以非常類似的方式反應(yīng)[33]。固定生物素化的肽α/β在傳感器表面，與高或低親和力的雌性激素α相互作用，這取決于受體構(gòu)象中存在的激動(dòng)劑或拮抗劑[39]。這些非常復(fù)雜的分子很難從自然資源中純化，也不可能合成，但它們具體應(yīng)用的可用性將是十分寶貴的。該方法對(duì)蛋白酶的活性進(jìn)行了一個(gè)靈敏和快速的評(píng)估。氧化石墨烯對(duì)于細(xì)胞周期蛋白A2的檢測(cè)優(yōu)于單壁碳納米管（SWNTs）。此信號(hào)機(jī)制使均相實(shí)時(shí)檢測(cè)肽與蛋白相互作用成為可能。該傳感器的定量限比其它報(bào)道檢測(cè)MMP2的低至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，可直接在人類血漿和全血樣品中檢測(cè)MMP2，得到了滿意的結(jié)果。該免疫傳感方法最初是在家兔血清中進(jìn)行，測(cè)試之前接種了合成肽，最終應(yīng)用于人類血清中ACPAs的檢測(cè)。該結(jié)果表明肽的破壞包含兩步，是一個(gè)二級(jí)反應(yīng)。 電化學(xué)發(fā)光分析法 電化學(xué)發(fā)光分析法概述電化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法，也稱電致化學(xué)發(fā)光，是由電化學(xué)方法引發(fā)的化學(xué)發(fā)光。因此，ECL也能避免在一些化學(xué)發(fā)光體系中不穩(wěn)定試劑的問(wèn)題，包括一些重要的體系，如Ru(bpy)32+ ECL和魯米諾ECL。另一方面，在ECL中需要的電化學(xué)技術(shù)在分析應(yīng)用中產(chǎn)生了一些局限性。商業(yè)ECL免疫分析和DNA探針檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品和水質(zhì)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物戰(zhàn)劑檢測(cè)、科研等領(lǐng)域。在共反應(yīng)物路徑中，發(fā)光體和共反應(yīng)物都存在時(shí)，通過(guò)在電極上一個(gè)定向的電位掃描產(chǎn)生ECL。在Scheme 1中，ECL反應(yīng)發(fā)生如下（方程（14）（18））。Ru(bpy)32+/ TPrA體系的ECL強(qiáng)度極大的依賴于溶液的pH。魯米諾BSA地高辛的免疫復(fù)合體和抗地高辛抗體結(jié)合之后的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比結(jié)合之前的魯米諾BSA地高辛的免疫復(fù)合體的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度小。Fab分子包含了結(jié)合抗原的氨基酸序列，由一個(gè)恒定區(qū)和可變區(qū)組成，可變區(qū)包含抗體的每一個(gè)重鏈和輕鏈。漆紅蘭[66]等人提出了一種均相的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)人類免疫球蛋白G（hIgG），在金納米粒子修飾的石蠟浸漬的石墨電極（PIGE）上，異魯米諾（ABEI）作為發(fā)光標(biāo)記物。釕二氧化硅(釕聯(lián)吡啶摻雜二氧化硅)覆蓋的納米金(NPG)(RusilicaNPG)復(fù)合物被用來(lái)作為一個(gè)極好的標(biāo)記物，帶有放大技術(shù)。隨著目標(biāo)DNA濃度的增加，信號(hào)降低。該碳納米點(diǎn)萘酚納米復(fù)合膜具有高的靈敏度、好的重復(fù)性和再生性能，對(duì)于AFP的定量有一個(gè)寬的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。該工作通過(guò)使用納米材料作為捕獲探針和信號(hào)探針的載體放大電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，提高適體傳感器的靈敏度，是一種很有前途的方法。通過(guò)共價(jià)偶合包含氨基的釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru1）或者可卡因適體Ru1在一個(gè)石蠟浸漬的石墨電極上，之前電極通過(guò)電化學(xué)氧化共價(jià)修飾了4對(duì)氨基苯磺酸單層。電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，簡(jiǎn)稱ECL），又稱電致化學(xué)發(fā)光，兼有電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光的雙重優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究中。同時(shí)考察基于分子邏輯門的多種生物標(biāo)示物的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究。崔華等利用異魯米諾功能化的金納米粒子為標(biāo)記物設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)發(fā)光免疫傳感檢測(cè)人類cTnI的分析方法 [12]。我們實(shí)驗(yàn)室利用魯米諾和釕聯(lián)吡啶作為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，BSA作為載體蛋白，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)地高辛的均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析[21]。選擇cTnI作為目標(biāo)蛋白，肽(FYSHSFHENWPSK)作為分子識(shí)別元件。 實(shí)驗(yàn)部分 儀器與試劑肽（FYSHSFHENWPSK， MW=），純度大于95%，廣州特立生物科技有限公司（中國(guó)）合成；心肌肌鈣蛋白I（cTnI，人類心臟）購(gòu)自Abcam公司（劍橋，英國(guó)），人類甲胎蛋白（AFP）購(gòu)自Fitzgerald Industries International公司（美國(guó)），人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（中國(guó)），雞蛋白蛋白購(gòu)自中美生物技術(shù)有限公司（中國(guó)），其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用溶液均用Millipore Milli Q（ WM）水配制。將標(biāo)記混合物以100mM pH = PBS作為透析液，通過(guò)透析袋（截留分子量 2000）進(jìn)行純化。Ru肽表現(xiàn)出了和Ru(bpy)2(dcbpy)NHS類似的電化學(xué)發(fā)光行為，進(jìn)一步確定Ru(bpy)2(dcbpy)NHS已經(jīng)標(biāo)記在肽上。曲線a和曲線b比較，可以看到Ru肽有一個(gè)高的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)（a，7309），109g/mL cTnI作用之后的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)相對(duì)較低（b，5550）。Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，105 cm2/s， 107 cm2/s 及 108 cm2/s（根據(jù)斜率((2/π3/2)aD1/2計(jì)算，a是微電極的半徑)。我們研究了Ru肽與cTnI的結(jié)合時(shí)間對(duì)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)合時(shí)間的增加，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)降低。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 線性范圍和檢出限在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下。電化學(xué)發(fā)光探針與cTnI作用后電化學(xué)發(fā)光值顯著降低(43%)，% (IgG)、% (BSA )、% (AFP ) 、% (雞蛋白蛋白)。109 g/mL %。這表明60min足夠使體系達(dá)到平衡。Park已經(jīng)報(bào)道了肽和cTnI的結(jié)合[25]。 (B) ECL intensitypotential profiles of 108 M Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (a) and 108 M Rupeptide (b) in M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. Scan rate, 50 mV/s.為了研究電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低的原因，我們利用電化學(xué)方法考察Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，Ru肽及Ru肽蛋白的擴(kuò)散系數(shù)[39]。通過(guò)?；磻?yīng)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS與肽右端賴氨酸（K）上的氨基共價(jià)連接，制得電化學(xué)發(fā)光肽探針。 結(jié)果與討論 電化學(xué)發(fā)光探針的表征首先對(duì)制備的電化學(xué)發(fā)光探針（Ru肽）利用紫外可見(jiàn)光譜以及電化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行表征。檢測(cè)時(shí)光電倍增管(PMT)的高壓為900，除非另外的聲明。電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)釕聯(lián)吡啶衍生物(Ru(bpy)2(dcbpy)NHS)標(biāo)記肽(FYSHSFHENWPSK)形成Ru肽探針。生物檢測(cè)中最關(guān)鍵的部分可能就是分子識(shí)別元件（如抗體，適體，酶，核酸，受體等）[23]。均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析法無(wú)需洗滌、分離等步驟，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)在臨床上受到人們的廣泛關(guān)注。目前已報(bào)道的檢測(cè)cTnI的方法有，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[3]，表面等離子體共振免疫傳感分析[4]，熒光免疫分析[56]，側(cè)向流動(dòng)免疫分析[7]，電化學(xué)免疫分析[811]，電化學(xué)發(fā)光免疫分析[1213]等。主要展開(kāi)了兩個(gè)方面的研究工作：（1）以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的均相電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的研究。檢測(cè)限比報(bào)道的基于適體的交流電流伏安和光學(xué)可卡因生物傳感器的檢測(cè)限低4到6個(gè)數(shù)量級(jí)。包含目標(biāo)物的夾心型復(fù)合物被微磁性粒子選擇性捕獲，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度定量。分析物凝血酶的加入引起了適體傳感器中釕復(fù)合物標(biāo)記Tgt適體的解離，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著的降低。該工作研究了魯米諾在碳納米點(diǎn)/萘酚/玻碳電極上的相對(duì)電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光性能。該免疫傳感器具有高的靈敏度，好的特異性及穩(wěn)定性，可以成為一種有前途的技術(shù)用于腫瘤標(biāo)示物檢測(cè)。109g/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，1011g/mL（S/N=3）。通過(guò)一整夜的孵化之后，這兩個(gè)標(biāo)記分子和單抗結(jié)合，生成的免疫復(fù)合物被鏈霉親和素附著的順磁珠捕獲，用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行分析。109g/%。而均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析不需要洗滌、分離等步驟，因其操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注。這個(gè)過(guò)程的好處在于總的ECL強(qiáng)度依賴于Ru(bpy)32+的濃度。通過(guò)電化學(xué)氧化產(chǎn)生還原性介質(zhì)的ECL體系被稱為“氧化還原”ECL體系。湮滅ECL機(jī)理通常由如下（方程（1）（6））表示，這里的1A* 和3A*各自代表單重態(tài)物種和三重態(tài)物種。在20世紀(jì)60年代中期，人們報(bào)道了涉及有機(jī)化合物ECL發(fā)射的第一個(gè)詳細(xì)的研究，但是報(bào)道關(guān)于電解過(guò)程中光發(fā)射的日期追溯至20年代?？刂莆恢靡材茉谙嗤臉悠分惺褂枚鄠€(gè)電極檢測(cè)多個(gè)分析物，以及發(fā)展ECL顯微鏡學(xué)。這些反應(yīng)物的再生使他們?cè)俅螀⑴cECL反應(yīng)，過(guò)量的共反應(yīng)物和ECL發(fā)光體反應(yīng)產(chǎn)生光，每個(gè)測(cè)量周期產(chǎn)生許多光子，極大地增強(qiáng)了該方法的靈敏度。 基于卟啉非共價(jià)功能化的石墨烯肽傳感器檢測(cè)周期蛋白A2示意圖 Schematic illustration of the porphyrin noncovalently functionalized graphenebased peptide sensor for cyclin A2 detection.Mahmoud[60]等采用了一種快速和簡(jiǎn)單的電化學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)人類免疫缺陷病毒（HIV）病人血清中蛋白酶（HIV1 PR）的存在。朱本占[58]等建立了一種簡(jiǎn)單和靈敏的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)通過(guò)費(fèi)頓反應(yīng)（Fe2+/H2O2）產(chǎn)生的氫氧自由基誘導(dǎo)的酪氨酸氧化。Mendoza[56]設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的安培免疫傳感器裝置，用于檢測(cè)血清抗瓜氨酸肽抗體（ACPAs）（），它特異性于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）自身免疫疾病。通過(guò)肽和CNPs之間的ππ相互作用開(kāi)始了FRET過(guò)程，因此 均相檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白A2原理圖 Schematic illustration for the homogeneous assay for cyclin A2 by using preferential quenching of ?uorescence from unbound P1 by GO. It should be noted that the illustration is only a graphic presentation and does not represent the scale of each ponent and the precise way that P1 binds onto GO. 使用芘標(biāo)記肽和氧化石墨烯監(jiān)測(cè)蛋白肽相互作用原理圖Fig. Schematic illustration of the concept of using pyrenelabeled peptide and GO to monitor proteinpeptide interactions猝滅了供體的熒光。楊黃浩[54]等采用了一種熒光方法監(jiān)測(cè)肽與蛋白相互作用，基于芘標(biāo)記肽和氧化石墨烯（GO）的組裝（）。 多個(gè)蛋白酶檢測(cè)原理圖Fig. Cartoon illustrating the assay for multiple proteinases (trypsin, chymotrypsin, proteinase K and thermolysin) using the same AuNPspeptide?uorophore conjugates.細(xì)胞周期蛋白A2是癌癥早期階段的一個(gè)預(yù)知的標(biāo)示物。 熒光光譜法熒光光譜法是以物質(zhì)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性關(guān)系為依據(jù)進(jìn)行的定量分析，以熒光光譜的形狀和熒光峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行的定性分析，因其具有靈敏度高，樣品用量少，選擇性強(qiáng)，信息多樣，方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域中。原則上，對(duì)于任何一種目標(biāo)物，可以嘗試摸索出來(lái)自同一商業(yè)文庫(kù)的肽受體，然而結(jié)果是相當(dāng)難以預(yù)測(cè)的，肽的性能可能比抗體好很多[40，43]，或者也許差很遠(yuǎn)[32，45]。然而，使用噬菌體展示的主要優(yōu)點(diǎn)在于許多粘合劑肽的產(chǎn)生來(lái)自于完全隨機(jī)文庫(kù)，都不包含任何肽結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)的元素[3537]。如果目標(biāo)物展示在抗生物素生物素表面，與連接器甚至與抗生物素蛋白的交叉反應(yīng)，往往是一個(gè)問(wèn)題。當(dāng)它們從細(xì)胞中釋放時(shí)，這個(gè)雜交的外殼蛋白隨即被納入噬菌體微粒，肽被展示在病毒粒子上（）[29]。在硅片上設(shè)計(jì)一個(gè)能夠結(jié)合選定目標(biāo)的肽需要反復(fù)地優(yōu)化目標(biāo)函數(shù)（例如，結(jié)合力），根據(jù)不同于它們主序列的候選肽庫(kù)。一個(gè)極高水平設(shè)計(jì)的復(fù)雜肽已被用于發(fā)展JR2EC和KE2C，一對(duì)42個(gè)氨基酸的合成肽[27]。rster resonance energy transfer, HCV hepatitis C virus, LOD limit of detection, PCBs polychlorinated biphenyls, QCM quartz crystal microbalance, SPR surface plasmon resonance, SPRI surface plasmon resonance imaging, VOCs volatile organic pounds半胱氨酸氨基末端肽[18]，硫辛酰螺旋肽[19，20]以及酸末端有巰基的兩親的β肽[21]能夠在金電極表面形成自組裝單層，提供了一個(gè)有利的手段操縱金屬納米粒子的表面性能。已從組合肽庫(kù)篩選中獲得了皮克每毫升二惡英五肽粘合劑[15]，并用非天然氨基酸進(jìn)行了設(shè)計(jì)修改[16]。設(shè)計(jì)離子敏感肽的靈感也來(lái)自于更復(fù)雜的自然生成的基序：鋅指肽序列已被用于建立一個(gè)鋅福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光傳感器[11]。最簡(jiǎn)單卻最有效的肽的設(shè)計(jì)涉及到傳感器中的活性元素，這被發(fā)現(xiàn)在離子選擇性電極，如銅，鎳，鋅等金屬。人們通過(guò)設(shè)計(jì)基于單個(gè)或幾個(gè)氨基酸與目標(biāo)物已知的相互作用而合成的肽，獲得靈敏和復(fù)雜的傳感器。大量的研究結(jié)果