【正文】 以肽為分子識別物質(zhì)的新型電化學(xué)發(fā)光生物傳感方法的研究畢業(yè)論文目 錄摘 要 IAbstract III第一章 引言 1 肽 2 肽的概述 2 肽應(yīng)用于生物傳感的來源 2 以肽為分子識別物質(zhì)的生物分析法研究進(jìn)展 11 熒光光譜法 12 電化學(xué)方法 15 電化學(xué)發(fā)光分析法 17 電化學(xué)發(fā)光分析法概述 17 電化學(xué)發(fā)光生物分析法研究進(jìn)展 21 本論文的研究目的及意義 26第2章 以肽為分子識別物質(zhì)的均相電化學(xué)發(fā)光法檢測心肌肌鈣蛋白I 28 引言 28 實驗部分 40 儀器與試劑 40 電化學(xué)發(fā)光探針的制備 41 電化學(xué)發(fā)光檢測cTnI 41 結(jié)果與討論 42 電化學(xué)發(fā)光探針的表征 42 電化學(xué)發(fā)光探針對cTnI的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng) 42 實驗條件的優(yōu)化 45 線性范圍和檢出限 46 選擇性 47 樣品分析 48 結(jié)論 49第3章 以肽為分子識別物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測活性前列腺特異性抗原 51 引言 51 實驗部分 52 儀器與試劑 52 電化學(xué)發(fā)光探針的制備 53 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備 54 電化學(xué)發(fā)光檢測PSA 55 結(jié)果與討論 55 電化學(xué)發(fā)光探針的表征 55 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器對PSA的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng) 56 實驗條件的優(yōu)化 57 電化學(xué)發(fā)光肽生物傳感器的性能 59 64 結(jié)論 65結(jié) 論 67參考文獻(xiàn) 69致 謝 87攻讀碩士期間主要研究成果 89第1章 引言第一章 引言心臟病、惡性腫瘤等疾病正在嚴(yán)重威脅著人類的生命，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，研究病源、基因和藥物以便于建立簡單、特異、敏感和快速的病源、基因和藥物檢測方法，這對于早期預(yù)防、診斷和治療疾病具有極其重要的意義。生物傳感器[1]是由生物分子識別元件（如酶、抗體或單鏈DNA等）與適當(dāng)?shù)男盘栟D(zhuǎn)換元件偶聯(lián)構(gòu)成的分析器件，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、操作簡單等優(yōu)點，是現(xiàn)代分析檢測的重要工具。在生物傳感器分子識別元件中，酶和抗體的制備比較繁瑣、固定時間和保存時間過長均易失活、使用時對環(huán)境和樣品條件的要求也比較高。DNA生物傳感器是指固定在基體表面的探針DNA分子與樣品中的靶DNA進(jìn)行雜交，通過檢測探針分子的雜交信號，進(jìn)而獲取靶DNA的相關(guān)信息。近年來，通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選得到的寡核苷酸肽，不僅具備類似抗體對靶分子的高親合力、高特異性、分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、易合成和可進(jìn)行連接性修飾等特點，而且可反復(fù)使用和長期保存，在疾病診斷的檢測方面受到人們的關(guān)注。但因目前篩選的適體鏈種類較少，使用范圍受到限制。探索具有高特異性、高穩(wěn)定性的新型生物分子識別元件，建立高選擇型、高靈敏度的生物傳感新技術(shù)是當(dāng)前分析化學(xué)研究所面臨的一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。利用噬菌體展示技術(shù)合成的肽與抗體相比，具有高的親和性，極強(qiáng)的生物活性和多樣性，且分子量小，易于改造，易于化學(xué)合成，價格低廉，可在極端條件下使用，無毒副作用等優(yōu)點，已作為分子識別物質(zhì)在生物傳感器的研制方面得到人們的廣泛關(guān)注。電化學(xué)發(fā)光[2]是化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，集成了發(fā)光分析高靈敏度、線性范圍寬和電化學(xué)電位可控性、選擇性好等優(yōu)點，引起了分析化學(xué)工作者廣泛的關(guān)注。本論文的引言部分?jǐn)M簡單介紹肽及肽的來源，著重評述以肽作為分子識別物質(zhì)的生物分析法的研究進(jìn)展；同時介紹電化學(xué)發(fā)光分析法的分類并評述均相電化學(xué)發(fā)光分析法的研究進(jìn)展；在此基礎(chǔ)上，提出本論文的研究目的及意義。 肽 肽的概述肽是由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵共價連接形成的聚合物，組成蛋白質(zhì)的20個天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成不同的肽類。氨基酸的不同側(cè)鏈對肽的生化模式起著重要的作用。肽按其組成氨基酸的數(shù)目分為不同的種類：通常由210個氨基酸組成的肽稱為寡肽（小分子肽）；1050個氨基酸組成的肽稱為多肽；含有50個以上氨基酸殘基的肽衍生物則被歸類于蛋白質(zhì)[3]。所以從本質(zhì)上來說，蛋白質(zhì)與肽均是由氨基酸分子構(gòu)成的，只是構(gòu)成分子的數(shù)量不同而已。由于肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，所以許多肽也具有氨基酸和蛋白質(zhì)所沒有的新功能。肽存在于生物體內(nèi)的濃度很低，血液中一般僅為1010mol/L，但其生理活性很強(qiáng)，在調(diào)節(jié)生理功能過程中起著重要的作用[4]。近幾十年以來，肽在人體中所起的作用已逐漸引起科學(xué)界的高度重視。大量的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)攝入人體后大部分以肽的形式吸收，并不是完全水解成氨基酸，同時發(fā)現(xiàn)，肽被吸收的速度比相同組成的氨基酸分子要快。而且肽類藥物的主要特點是用量小、生物活性強(qiáng)，對自身免疫性疾病、癌癥、精神失常、高血壓、記憶力減退和代謝及某些心血管等疾病有顯著的療效，具有廣泛的應(yīng)用前景[5]?？傊?，肽涉及人體的神經(jīng)、激素、生殖和細(xì)胞生長等多個領(lǐng)域，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、保健、衛(wèi)生、食品、化妝品等方面。隨著醫(yī)學(xué)及生化技術(shù)的發(fā)展，肽類藥物因具有原料簡單易得、藥效高、副作用低、不蓄積中毒、用途廣泛、種類繁多等優(yōu)點，已成為21世紀(jì)重要的診斷、監(jiān)測、預(yù)防和治療藥物。因此，肽類藥物的研究是目前醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中最活躍、進(jìn)展最快的部分，也是21世紀(jì)最有前途的產(chǎn)業(yè)之一。肽對于模仿發(fā)生在酶、抗體、藥物受體和跨膜蛋白等生物大分子中的分子識別機(jī)制是一個很好的選擇。相比于傳統(tǒng)的生物大分子，肽具有分子量小、易于改造、易于化學(xué)合成、價格低廉、可在極端條件下使用、無毒副作用等優(yōu)點，已作為分子識別物質(zhì)在生物傳感器的研制方面得到人們的廣泛關(guān)注。 肽應(yīng)用于生物傳感的來源近年來根據(jù)不同的策略，建立了基于肽的傳感器。人們通過設(shè)計基于單個或幾個氨基酸與目標(biāo)物已知的相互作用而合成的肽，獲得靈敏和復(fù)雜的傳感器。但由于設(shè)計的肽在硅片設(shè)計中的應(yīng)用極為困難，此類傳感器的使用受到了很大限制。肽是以隨機(jī)的方式從大的、不集中的、常常先前就存在以及市場上可買到的噬菌體展示庫中選擇，沒有設(shè)計元素。這樣的肽往往比抗體有更好的性能，但當(dāng)目標(biāo)物是小分子時它們很難選擇，因為固定它相當(dāng)是修改其結(jié)構(gòu)。人工、微型化的受體可從已知序列的天然受體壓縮到一個可合成、但性質(zhì)穩(wěn)定的受體中獲得。另外，結(jié)合位點已經(jīng)建立在一個設(shè)計、穩(wěn)定的肽支架上。目前，肽已被利用作為活性元素來檢測自己的天然受體，抗菌劑和細(xì)胞滲透肽已用來檢測致病菌。但仍存在很多問題，例如怎樣實現(xiàn)細(xì)菌在實際樣品中的檢測，如何提高方法靈敏度和選擇性，是我們不得不面臨的重大挑戰(zhàn)。最簡單卻最有效的肽的設(shè)計涉及到傳感器中的活性元素，這被發(fā)現(xiàn)在離子選擇性電極，如銅，鎳，鋅等金屬。這個話題在2006年Chow and Gooding [6]就評論過，在這里，我們報道一些近來令人關(guān)注的例子（如表1所示）。即使是非常簡單的三肽GlyGlyHis，因為肽與銅的選擇性相互作用，設(shè)計上體現(xiàn)了離子選擇性，然而它的同分異構(gòu)體GlyHisGly與銅和鋅能夠交叉反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，建立了一個場效應(yīng)晶體管選擇性對銅敏感和一個聚吡咯納米線電極[7，8]。銅被肽絡(luò)合的機(jī)制已在金微懸臂梁表面進(jìn)行了直接的研究[9]，根據(jù)銅的濃度和時間產(chǎn)生不同的響應(yīng)。這個結(jié)果與兩種不同的銅肽復(fù)合物的存在是一致的：一個單配位基、低親和力的復(fù)合物通過組氨酸快速的形成（圖1），然后這個體系以緩慢的步驟形成一個四配位基絡(luò)合物，由于肽單層體積的改變，在懸臂上產(chǎn)生了一個不同的響應(yīng)。這個結(jié)果也解釋了肽的離子選擇性， GlyHisGly同分異構(gòu)體由于空間原因可能無法形成四配位基絡(luò)合物，通過組氨酸形成的單配位基絡(luò)合物沒有選擇性。一個更高水平的設(shè)計體現(xiàn)在一個八肽形成聚集的納米小纖維覆蓋在電極表面，在銅結(jié)合之后構(gòu)象改變，因而修飾了電極的活性[10]。設(shè)計離子敏感肽的靈感也來自于更復(fù)雜的自然生成的基序：鋅指肽序列已被用于建立一個鋅福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光傳感器[11]。該鋅指肽在鋅結(jié)合之后構(gòu)象改變，一個熒光團(tuán)/猝光劑連接在肽的末端，通過測定熒光的猝滅來檢測鋅。已知和鎳相互作用的肽序列（來自于破傷風(fēng)毒素（P12），C型肝炎病毒，片段（NS4/7）以及一個聚H的序列）已被用于基于微陣列的表面等離子體共振成像，對肽和金屬的相互作用或者金屬含量進(jìn)行多參數(shù)和同時分析，以便于監(jiān)測一個大型面板上金屬介導(dǎo)的生物活性[12]。一個電極表面附著肽納米管，自組裝肽作為識別分子，與鉛離子結(jié)合。鉛離子與傳感肽絡(luò)合之后，肽納米管上獲得形核作用的鉛減少。在等效電路中表面連接金屬作為一個電阻器被檢測， nM范圍內(nèi)[13]，這是前所未見的。小的有機(jī)分子也已通過設(shè)計的寡肽檢測。在石英晶體微天平上進(jìn)行了各種類別的揮發(fā)性有機(jī)化合物的同時檢測和識別，微天平上附著有合成肽的一個傳感模塊，肽來自于硅片的設(shè)計和選擇，連同導(dǎo)電聚合物[14]。已從組合肽庫篩選中獲得了皮克每毫升二惡英五肽粘合劑[15]，并用非天然氨基酸進(jìn)行了設(shè)計修改[16]。含有非天然氨基酸的如此短的序列所獲得的靈敏度，與先前作者用純天然寡肽檢測阿特拉津和其他氯化除草劑所獲得的結(jié)果相比，是一個明顯的進(jìn)步[17]。 銅在三肽附著的微懸臂上的選擇性結(jié)合Fig. Selective binding of copper to a microcantilever coated with the GlyGlyHis tripeptide. EDC NethylN(dimethylaminopropyl)carbodiimide, MPA mercaptoproprionic acid, NHS Nhydroxysuccinimide. 基于設(shè)計合成肽傳感器Table Sensors based upon designed synthetic peptidesReference TargetSensing peptideSensorSensitivitySelectivity[7]Cu2+3mer GGHSilicon nanowire FET1 nM to 1 mMCu2+ in the presence of Zn2+[8]Cu2+3mer GGHPolypyrrole nanowire electrode20–300 nM[9]Cu2+3mer GGHMicrocantilever1 μMto1mM[10]Cu2+8mer NCGAITIGIonselective electrode15–50 μM[11]Zn2+Zincfinger peptideFRET fluorimetric[12]Ni2+Tetanus toxin (P12)。HCV sequence (NS4/7)。polyH sequenceSPRI microarrayLOD 10 μM, similar to what it is usually obtained with labelfree biosensors for ions[14]VOCsShortchain polypeptides。PAC1, PAC2,PAM1, PAM2QCMMilligram per milliliterPAC1, PAC2, PAM2 to acetic acid。 PAC1, PAC2 to butyric acid。 PAM1, PAM2 to dimethyl amine[15]Dioxins andPCBs[N]NFQGaa[C]QCM[16]DioxinsFLDQPhenylglycineand other designedpentamersOnbead fluorescence microscopyLOD ng/mlVery detailed data on crossreactivity with chlorinated dioxins (+) PCBs (?), chlorinated dibenzofurans (+)[17]Atrazine,diuronEYYY and other4mers frombinatorial librariesSPR200 μMto1mM[27]Carbonicanhydrase42mer helix–loop–helix peptideAssembly of gold nanoparticlesLOD 10 nM, dynamic range 10–100 nMPartial crossreactivity with human albuminaa amino acid, FET fieldeffect transistor, FRET F246。rster resonance energy transfer, HCV hepatitis C virus, LOD limit of detection, PCBs polychlorinated biphenyls, QCM quartz crystal microbalance, SPR surface plasmon resonance, SPRI surface plasmon resonance imaging, VOCs volatile organic pounds半胱氨酸氨基末端肽[18]，硫辛酰螺旋肽[19，20]以及酸末端有巰基的兩親的β肽[21]能夠在金電極表面形成自組裝單層，提供了一個有利的手段操縱金屬納米粒子的表面性能。近來，為了仿造蛋白質(zhì)的化學(xué)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使用一個納米工程學(xué)的方法設(shè)計的肽覆蓋基質(zhì)表面，賦予一定的穩(wěn)定性[22]，極小的非特異性相互作用[23]，并且提供了一個適當(dāng)?shù)哪０逵脕斫Y(jié)合幾個分子受體或者識別官能團(tuán)[23，24]。大部分的這些序列，例如CALNN和 3巰基丙酸(Ser)5OH，通過合理或組合設(shè)計來提供。我們報道了兩個生物傳感器，利用自組裝肽作為分子識別元件，檢測肉毒素A和萬