【正文】 表明，蛋白質(zhì)攝入人體后大部分以肽的形式吸收，并不是完全水解成氨基酸，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，肽被吸收的速度比相同組成的氨基酸分子要快。本論文的引言部分?jǐn)M簡(jiǎn)單介紹肽及肽的來(lái)源，著重評(píng)述以肽作為分子識(shí)別物質(zhì)的生物分析法的研究進(jìn)展；同時(shí)介紹電化學(xué)發(fā)光分析法的分類并評(píng)述均相電化學(xué)發(fā)光分析法的研究進(jìn)展；在此基礎(chǔ)上，提出本論文的研究目的及意義。生物傳感器[1]是由生物分子識(shí)別元件（如酶、抗體或單鏈DNA等）與適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換元件偶聯(lián)構(gòu)成的分析器件，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代分析檢測(cè)的重要工具。探索具有高特異性、高穩(wěn)定性的新型生物分子識(shí)別元件，建立高選擇型、高靈敏度的生物傳感新技術(shù)是當(dāng)前分析化學(xué)研究所面臨的一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。由于肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，所以許多肽也具有氨基酸和蛋白質(zhì)所沒(méi)有的新功能。肽對(duì)于模仿發(fā)生在酶、抗體、藥物受體和跨膜蛋白等生物大分子中的分子識(shí)別機(jī)制是一個(gè)很好的選擇。另外，結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)建立在一個(gè)設(shè)計(jì)、穩(wěn)定的肽支架上。這個(gè)結(jié)果與兩種不同的銅肽復(fù)合物的存在是一致的：一個(gè)單配位基、低親和力的復(fù)合物通過(guò)組氨酸快速的形成（圖1），然后這個(gè)體系以緩慢的步驟形成一個(gè)四配位基絡(luò)合物，由于肽單層體積的改變，在懸臂上產(chǎn)生了一個(gè)不同的響應(yīng)。在等效電路中表面連接金屬作為一個(gè)電阻器被檢測(cè)， nM范圍內(nèi)[13]，這是前所未見(jiàn)的。PAC1, PAC2,PAM1, PAM2QCMMilligram per milliliterPAC1, PAC2, PAM2 to acetic acid。由表面基質(zhì)毒素的分裂測(cè)量熒光強(qiáng)度，這個(gè)傳感器能檢測(cè)肉毒素A低至3 pg/mL，比要求的檢測(cè)限低十倍[25]。 鋅離子促進(jìn)螺旋環(huán)螺旋的折疊允許納米粒子聚集，目標(biāo)物的識(shí)別使平衡向分散納米粒子的方向移動(dòng)Fig. Zn2+promoted folding of helix–loop–helix peptides allows nanoparticle aggregation. Recognition of the target shifts the equilibrium towards dispersed nanoparticles.設(shè)計(jì)的肽因此成為發(fā)展離子、小分子甚至蛋白傳感器的強(qiáng)大工具，并在裝置的傳感表面引進(jìn)高層次的組織。在噬菌體展示肽中，其特性(如識(shí)別和結(jié)合)是與基因編碼它的基本序列相關(guān)的。通常在一個(gè)小的有機(jī)目標(biāo)分子（例如一種藥物）中發(fā)現(xiàn)的是極少數(shù)的官能團(tuán)，它們中的每一個(gè)也許提供一個(gè)和潛在受體的基本相互作用點(diǎn)。然而，使用已選定肽在熒光流量傳感器中的檢測(cè)限高達(dá)12 mg/ml，最可能是由于肽無(wú)法識(shí)別未改變的、自由的TNT。利用隨機(jī)噬菌體展示肽發(fā)展起來(lái)的生物傳感器系統(tǒng)的匯集如表2所示。鑒于這些原因設(shè)計(jì)了短的，基于肽的，能高特異性識(shí)別的人工受體，是生物技術(shù)的目標(biāo)之一，以獲取競(jìng)爭(zhēng)劑、抑制劑、藥物、親和純化系統(tǒng)試劑及生物傳感器中的活性元素[51]。這個(gè)方法的“addmixmeasure”格式消除了冗長(zhǎng)的納米探針加工，極大的減少了檢測(cè)時(shí)間，使它更有普遍性。比使用SWNTs的好10倍，比最近報(bào)道的使用Tb3+螯合大環(huán)修飾p21(WAF1)肽的檢測(cè)限（）好1200倍?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是血液中一個(gè)非常重要的生物標(biāo)示物。 Schematic illustration (not to scale) of the MMP2 biosensor based on FRET from peptidelinked UCPs to CNPs 電化學(xué)方法電化學(xué)方法主要以電位、電流、電量或電導(dǎo)等電化學(xué)參數(shù)作為考察的對(duì)象，來(lái)研究溶液中被測(cè)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化。通過(guò)與捐贈(zèng)者的對(duì)照血清進(jìn)行對(duì)比，該免疫傳感器用于檢測(cè)存在于RA病人血清中的抗CFFCP1抗體具有高選擇性和高靈敏度。（主語(yǔ)）使用X射線光電子能譜定量測(cè)定了肽附著的電極表面氮元素的百分比，消除了由肽主鏈分裂引起的信號(hào)降低的可能性。與化學(xué)發(fā)光相類似，ECL不需要使用外部光源。第三，它有可能電化學(xué)活化一些化合物成為能參與一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的物種，因此擴(kuò)展了一個(gè)特定化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可檢測(cè)分析物的范圍。例如，ECL需要一種電化學(xué)設(shè)置和電極表面的頻繁更新，以確保良好的再現(xiàn)性。利用電化學(xué)發(fā)光可以檢測(cè)許多分析物，特別是含有氨的分析物，通過(guò)結(jié)合高效液相色譜（HPLC）、流動(dòng)注射分析（FIA）、毛細(xì)管電泳（CE）和微觀全面分析體系(μTAS)，出現(xiàn)了一些新的電化學(xué)發(fā)光體系，使ECL的應(yīng)用范圍更廣。例如，草酸根離子（C2O42）是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)共反應(yīng)物。Ru(bpy)32+和TPrA在電極表面均被氧化，通過(guò)TPrA?還原Ru(bpy)33+產(chǎn)生激發(fā)態(tài)。ECL強(qiáng)度的最大值大約發(fā)生在pH=，這非常適合應(yīng)用于生物體系。兩個(gè)免疫檢測(cè)平臺(tái)，一個(gè)是直接的均相免疫檢測(cè)抗地高辛抗體，一個(gè)是競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)地高辛。在臨床試驗(yàn)中，單抗劑量患者的藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)估需要高的檢測(cè)靈敏度。異魯米諾標(biāo)記抗hIgG抗體產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在hIgG抗原存在時(shí)，顯著的增大，這是由于異魯米諾形成了一個(gè)更加剛性的結(jié)構(gòu)。納米金的制備通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的脫合金成分腐蝕，銀/金合金中的銀在硝酸中被選擇性溶解。檢測(cè)限為91011M。電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與AFP在兩個(gè)濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。邢達(dá)[71]等建立了一種有前景的適體傳感器用于高靈敏檢測(cè)蛋白和小分子，基于構(gòu)建的適體修飾的電化學(xué)發(fā)光納米探針。三丙胺（TPrA）和胃復(fù)安（MCP）作為模 電化學(xué)發(fā)光適體傳感器檢測(cè)凝血酶和ATP的設(shè)計(jì)原理圖Fig. Schematic description of the ECL aptasensor for human thrombin and ATP based upon the amplification of biobarcode method.Figure Schematic diagram of the fabrication of ECL chemical sensor and ECL aptamerbased biosensor for cocaine detection.型分析物評(píng)估了該化學(xué)傳感器的性能。目前，未檢索到以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光分析方法。在金電極上同時(shí)檢測(cè)博來(lái)霉素和PSA，發(fā)展了一種OR邏輯門，進(jìn)行博來(lái)霉素和PSA的同時(shí)檢測(cè)可行性的研究。Smith等建立了一種檢測(cè)鼠血清中的cTnI的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器[13]。然而，在這些免疫檢測(cè)中，具有大分子量的信號(hào)探針在和相應(yīng)的目標(biāo)物作用時(shí)，信號(hào)改變較小，且檢測(cè)需要多個(gè)步驟及很長(zhǎng)的孵育時(shí)間。Park識(shí)別了這個(gè)對(duì)人類cTnI有納摩爾親和力和特異性的肽(FYSHSFHENWPSK)[25]。電化學(xué)發(fā)光測(cè)量過(guò)程用MPIE型電化學(xué)發(fā)光儀（西安瑞邁電子公司，中國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。Ru肽溶液的濃度根據(jù)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS在457 105 M[3738]。曲線a和曲線b相比，在相同的濃度下，Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比Ru肽的高2倍多。曲線b和曲線c相比，可以看到隨著cTnI濃度的增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度從5550下降到2612。 電化學(xué)發(fā)光探針與不同濃度心肌肌鈣蛋白I結(jié)合前后的電化學(xué)發(fā)光圖Fig. ECL kinetic profiles of the 108 M ECL probe before (a) and after reacted with 109g/mL cTnI (b) and 108 g/mL cTnI (c). Experimental condition: binding time, 60 min。因而，Ru肽與cTnI的結(jié)合時(shí)間通過(guò)調(diào)查cTnI引起的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低來(lái)獲得最佳結(jié)合時(shí)間。 隨著cTnI濃度的增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。這表明Ru肽探針對(duì)cTnI有好的選擇性。當(dāng)心肌疾病發(fā)生的時(shí)候，血清中cTnI的含量在5到50ng/mL[40]，因此，這個(gè)方法足以用來(lái)檢測(cè)臨床樣品中的cTnI。結(jié)果可以看到，隨著結(jié)合時(shí)間從20min增加到60min，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低，60min以后穩(wěn)定（）。 applied potential, V. 釕聯(lián)吡啶衍生物肽（上，a）及釕聯(lián)吡啶衍生物肽蛋白（下，b）的氧化作用圖Fig. Plot of the experimental ratio it/id,ss against the inverse square root of time in M PBS with 10 μm radius Pt UME. (a) Oxidation at step potential ESP = + V vs SCE for 106 M Rupeptide, (b) Oxidation at step potential ESP = + V vs SCE for 106 M Rupeptideprotein conjugate.在此之前，研究了Ru(bpy)2(dcbpy)NHS在鉑超微電極上的線性掃描伏安，可以看到一個(gè)很好的氧化峰。 （A）肽，釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記肽（Ru肽）以及釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru）的紫外可見(jiàn)光譜圖 （B）釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru）及釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記肽（Ru肽）的電化學(xué)發(fā)光圖Fig. (A) UVVis spectra of peptide (a), Rupeptide (b) and Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (c)。 電化學(xué)發(fā)光探針對(duì)cTnI的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)本工作中，我們使用一個(gè)序列為FYSHSFHENWPSK的肽為分子識(shí)別物質(zhì)。通過(guò)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低值(△I= I0 –IS)來(lái)定量cTnI的濃度，IS是Ru肽與cTnI作用之后的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，I0是Ru肽的電化學(xué)發(fā)光空白值。該體系為傳統(tǒng)的三電極體系：玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，飽和Ag/AgCl作為參比電極。這個(gè)序列包含一個(gè)色氨酸（W）繼之以脯氨酸（P），這也許引起了一個(gè)能有效和目標(biāo)物結(jié)合的結(jié)構(gòu)的扭曲[3435]。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、靈敏、無(wú)需分離的方法用于檢測(cè)蛋白是免疫分析技術(shù)所面臨的一個(gè)長(zhǎng)期的目標(biāo)。因此，建立一種制備步驟極少，但仍然具有高靈敏度，值得信賴的方法，是分析化學(xué)家們追求的目標(biāo)。心肌肌鈣蛋白I (cTnI)，分子量為24kDa，是存在于心肌組織中的肌鈣蛋白復(fù)合體的一部分，已成為選擇用于檢測(cè)心肌損傷的一個(gè)可信賴的生物標(biāo)記物[12]。以肽作為分子識(shí)別物質(zhì)，釕聯(lián)吡啶衍生物為信號(hào)物質(zhì)，建立簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)疾病標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光分析方法?；谶m體的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，它對(duì)于可卡因有一個(gè)極低的檢測(cè)限為10pM，對(duì)于可卡因、海洛因及咖啡因提供了一個(gè)好的選擇性。通過(guò)利用兩個(gè)親和適體的高特異性三明治結(jié)合，釕聯(lián)吡啶（TBR）半胱胺負(fù)載在金納米粒子上，金納米粒子用于信號(hào)放大，基于電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的微磁性粒子（MMPs）用于快速檢測(cè)，建立了一個(gè)新的生物分子的定量檢測(cè)。在“signal off”型適體傳感器中，巰基捕獲探針（ssDNA，12mer）自組裝在金納米粒子上，金納米粒子自組裝在金電極表面，與包含標(biāo)記釕復(fù)合物的TBAⅠ（ssDNA，15mer）的單鏈DNA序列（Tgt適體，21mer）的六個(gè)堿基段雜交之后，產(chǎn)生一個(gè)高的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。陳國(guó)南[69]研究小組提出了一種簡(jiǎn)單和高度靈敏的基于一鍋合成碳納米點(diǎn)和萘酚復(fù)合膜的納米復(fù)合材料的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，用于檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）。 獲得的CEA的濃度在1pg/mL到10ng/mL范圍內(nèi)， pg/mL。發(fā)現(xiàn)在金納米粒子修飾的石蠟浸漬的石墨電極上異魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在中性水溶液存在過(guò)氧化氫時(shí)顯著的增大，異魯米諾的檢測(cè)限是21014mol/L（S/N=3）。在此工作中，釕標(biāo)記的親和純化兔抗單抗抗體和生物素化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子被添加到血清樣品中。108g/mL濃度范圍成良好的線性關(guān)系，1010g/mL。通用的非均相檢測(cè)系統(tǒng)在電極表面進(jìn)行，需要孵育、洗、分離等多個(gè)步驟。在Scheme 3中，僅僅Ru(bpy)33+在電極表面產(chǎn)生，產(chǎn)生的Ru(bpy)33+氧化TPrA。該體系中一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是草酸的氧化導(dǎo)致了一個(gè)強(qiáng)還原性介質(zhì)CO2?的產(chǎn)生，而不是一個(gè)氧化性介質(zhì)。在湮滅路徑中，通過(guò)電位階躍或者掃描氧化和還原物都產(chǎn)生在電極表面，這些物質(zhì)通過(guò)相互作用產(chǎn)生一個(gè)基態(tài)和一個(gè)電子激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)通過(guò)發(fā)射松弛。因此，它比化學(xué)發(fā)光弱得多，且對(duì)光探測(cè)器的靈敏度有更高的要求。例如，通過(guò)ECL結(jié)合磁珠技術(shù)進(jìn)行無(wú)分離分析，結(jié)合和未結(jié)合部分ECL信號(hào)有顯著的差異。首先，一些反應(yīng)物可在電極表面電化學(xué)再生。 層層自組裝肽生物傳感器表面示意圖 Schematic diagram of layerbylayer assembled peptide sensor surface.曲曉剛[59]研究小組采用了一種無(wú)標(biāo)記電化學(xué)阻抗法在癌細(xì)胞中檢測(cè)周期蛋白A2，具有極高的靈敏度和選擇性，通過(guò)利用卟啉（既能引進(jìn)更多的羧基連接肽，又不會(huì)影響石墨烯的傳導(dǎo)性能）非共價(jià)功能化的石墨烯修飾玻碳電極，將一個(gè)特異性六勝肽P0 (RWIMYF)作為檢測(cè)探針，吐溫20降低非特異性吸附。該傳感器能夠檢測(cè)來(lái)自于HPV16殼蛋白的抗原肽L1和相關(guān)抗體的相互作用。近年來(lái)，基于肽檢測(cè)蛋白、病毒等的電化學(xué)傳感器的研究取得了很大的進(jìn)展。劉志宏[55]等報(bào)道了一個(gè)均相檢測(cè)MMP2的生物傳感器，基于由上轉(zhuǎn)換熒光粉（UCPs）到碳納米粒子（CNPs）的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），設(shè)計(jì)了一個(gè)聚肽鏈（NH2GHHYYGPLGVRGCCOOH），它由特異性MMP2基質(zhì)區(qū)域（PLGVR）和一個(gè)富含π的基序（HHYY）組成，并且連接到UCPs表面的C端。在研究分子識(shí)別，篩選藥物以及設(shè)計(jì)生物傳感器中，監(jiān)測(cè)肽與蛋白相互作用是至關(guān)重要的。對(duì)于工業(yè)常規(guī)測(cè)試，臨床檢測(cè)及高通量篩選蛋白酶抑制劑是理想的檢測(cè)方法。大量生物模擬，基于肽的傳感系統(tǒng)已在近年來(lái)的文獻(xiàn)中報(bào)道，檢測(cè)方法大多為熒光和電化學(xué)方法。這顯然是隨機(jī)噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)