【正文】 it is usually obtained with labelfree biosensors for ions[14]VOCsShortchain polypeptides。已從組合肽庫篩選中獲得了皮克每毫升二惡英五肽粘合劑[15]，并用非天然氨基酸進行了設計修改[16]。鉛離子與傳感肽絡合之后，肽納米管上獲得形核作用的鉛減少。設計離子敏感肽的靈感也來自于更復雜的自然生成的基序：鋅指肽序列已被用于建立一個鋅福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光傳感器[11]。銅被肽絡合的機制已在金微懸臂梁表面進行了直接的研究[9]，根據(jù)銅的濃度和時間產(chǎn)生不同的響應。最簡單卻最有效的肽的設計涉及到傳感器中的活性元素，這被發(fā)現(xiàn)在離子選擇性電極，如銅，鎳，鋅等金屬。人工、微型化的受體可從已知序列的天然受體壓縮到一個可合成、但性質(zhì)穩(wěn)定的受體中獲得。人們通過設計基于單個或幾個氨基酸與目標物已知的相互作用而合成的肽，獲得靈敏和復雜的傳感器。因此，肽類藥物的研究是目前醫(yī)藥研發(fā)領域中最活躍、進展最快的部分，也是21世紀最有前途的產(chǎn)業(yè)之一。大量的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)攝入人體后大部分以肽的形式吸收，并不是完全水解成氨基酸，同時發(fā)現(xiàn)，肽被吸收的速度比相同組成的氨基酸分子要快。所以從本質(zhì)上來說，蛋白質(zhì)與肽均是由氨基酸分子構(gòu)成的，只是構(gòu)成分子的數(shù)量不同而已。本論文的引言部分擬簡單介紹肽及肽的來源，著重評述以肽作為分子識別物質(zhì)的生物分析法的研究進展；同時介紹電化學發(fā)光分析法的分類并評述均相電化學發(fā)光分析法的研究進展；在此基礎上，提出本論文的研究目的及意義。但因目前篩選的適體鏈種類較少，使用范圍受到限制。生物傳感器[1]是由生物分子識別元件（如酶、抗體或單鏈DNA等）與適當?shù)男盘栟D(zhuǎn)換元件偶聯(lián)構(gòu)成的分析器件，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、操作簡單等優(yōu)點，是現(xiàn)代分析檢測的重要工具。在生物傳感器分子識別元件中，酶和抗體的制備比較繁瑣、固定時間和保存時間過長均易失活、使用時對環(huán)境和樣品條件的要求也比較高。探索具有高特異性、高穩(wěn)定性的新型生物分子識別元件，建立高選擇型、高靈敏度的生物傳感新技術(shù)是當前分析化學研究所面臨的一項具有挑戰(zhàn)性的任務。 肽 肽的概述肽是由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵共價連接形成的聚合物，組成蛋白質(zhì)的20個天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成不同的肽類。由于肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，所以許多肽也具有氨基酸和蛋白質(zhì)所沒有的新功能。而且肽類藥物的主要特點是用量小、生物活性強，對自身免疫性疾病、癌癥、精神失常、高血壓、記憶力減退和代謝及某些心血管等疾病有顯著的療效，具有廣泛的應用前景[5]。肽對于模仿發(fā)生在酶、抗體、藥物受體和跨膜蛋白等生物大分子中的分子識別機制是一個很好的選擇。但由于設計的肽在硅片設計中的應用極為困難，此類傳感器的使用受到了很大限制。另外，結(jié)合位點已經(jīng)建立在一個設計、穩(wěn)定的肽支架上。這個話題在2006年Chow and Gooding [6]就評論過，在這里，我們報道一些近來令人關注的例子（如表1所示）。這個結(jié)果與兩種不同的銅肽復合物的存在是一致的：一個單配位基、低親和力的復合物通過組氨酸快速的形成（圖1），然后這個體系以緩慢的步驟形成一個四配位基絡合物，由于肽單層體積的改變，在懸臂上產(chǎn)生了一個不同的響應。該鋅指肽在鋅結(jié)合之后構(gòu)象改變，一個熒光團/猝光劑連接在肽的末端，通過測定熒光的猝滅來檢測鋅。在等效電路中表面連接金屬作為一個電阻器被檢測， nM范圍內(nèi)[13]，這是前所未見的。含有非天然氨基酸的如此短的序列所獲得的靈敏度，與先前作者用純天然寡肽檢測阿特拉津和其他氯化除草劑所獲得的結(jié)果相比，是一個明顯的進步[17]。PAC1, PAC2,PAM1, PAM2QCMMilligram per milliliterPAC1, PAC2, PAM2 to acetic acid。近來，為了仿造蛋白質(zhì)的化學和結(jié)構(gòu)復雜性，使用一個納米工程學的方法設計的肽覆蓋基質(zhì)表面，賦予一定的穩(wěn)定性[22]，極小的非特異性相互作用[23]，并且提供了一個適當?shù)哪０逵脕斫Y(jié)合幾個分子受體或者識別官能團[23，24]。由表面基質(zhì)毒素的分裂測量熒光強度，這個傳感器能檢測肉毒素A低至3 pg/mL，比要求的檢測限低十倍[25]。由于大量負電荷的存在，肽在中性PH條件下是展開的，然而在鋅離子存在時，羧基發(fā)生絡合作用，肽折疊成一個螺旋環(huán)螺旋構(gòu)象。 鋅離子促進螺旋環(huán)螺旋的折疊允許納米粒子聚集，目標物的識別使平衡向分散納米粒子的方向移動Fig. Zn2+promoted folding of helix–loop–helix peptides allows nanoparticle aggregation. Recognition of the target shifts the equilibrium towards dispersed nanoparticles.設計的肽因此成為發(fā)展離子、小分子甚至蛋白傳感器的強大工具，并在裝置的傳感表面引進高層次的組織。盡管這些方法已經(jīng)取得了重大成就，但計算的和實驗的蛋白設計仍然存在嚴重的技術(shù)問題。在噬菌體展示肽中，其特性(如識別和結(jié)合)是與基因編碼它的基本序列相關的。噬菌體展示庫含有多達109個不同的噬菌體克隆元素，每個通過隨機的基因序列產(chǎn)生一個不同的肽。通常在一個小的有機目標分子（例如一種藥物）中發(fā)現(xiàn)的是極少數(shù)的官能團，它們中的每一個也許提供一個和潛在受體的基本相互作用點。選擇肽粘合劑是相當困難的，肽粘合劑能區(qū)分固定化和自由存在的目標物，如先前報道的抗睪酮和抗甲氨蝶呤肽的選擇[30，31]。然而，使用已選定肽在熒光流量傳感器中的檢測限高達12 mg/ml，最可能是由于肽無法識別未改變的、自由的TNT。非設計肽庫也許可提供能夠區(qū)分目標物之間的精細結(jié)構(gòu)差異，甚至不同構(gòu)象的肽。利用隨機噬菌體展示肽發(fā)展起來的生物傳感器系統(tǒng)的匯集如表2所示。 基于隨機噬菌體展示肽傳感器Table Sensors based upon random phage display peptidesReferenceTargetSensing peptideSensorSensitivity[40]Murine myofibers7mer ASSLNIAAcoustic waveMurine skeletal proteins 10 μg/ml, apparent Kd 280 μg/ml Fast response (100 s), whereas a similar, antibodybased sensor shows 100min equilibration time[41]Ps. Aeruginosa wholecells9mer QRKLAAKLT resembling thesequence of natural CPPQCM[42]SW620 metastatic cells12merPotentiometric100 cells/ml blood[43]Anthrax protectiveantigen16mer HKHAHNYRLPASGGGKKSquare wave voltammetriKd pM, dynamic range 4–120 pM, LOD pM[44]Enterotoxin B12merFiber optical. The RAPTOR optical probe was used[41]Dynamic range 1031 μg/well, LOD 103 μg/well[45]Cardiac troponin I12mer FYSHSFHENWPSQCM and EISQCM: dynamic range μg/ml, LOD μg/ml EIS: LOD μg/ml[46]Streptavidin12mer from filamentous R5C2 phagesOptofluidic ring resonatorLOD 100 pM, apparent Kd 25 pM[31]Methotrexate11mer SIFPLCNSGAL selected directly on a QCM deviceQCM and SPRRange 2–50 μM, Kd μM[32]TNT12mers sharing a HR consensus dyadFluorimetric flow sensorDynamic range 6–100 mg/ml, LOD mg/ml[34]Porphyrin5mer HASYS peptide immobilized on latex beads to allow 2:1 peptidetotarget plex formationQCMDynamic range μg/ml, LOD μg/ml[39]EDCsPeptide α/β IRIFSERαLBD 100μg/mL incubated with 10 μg/mL βestradiol and with 10 μg/mL tamoxifen Discrimination between agonists and antagonists of ERαCPP cellpenetrating peptide, EDCs endocrinedisrupting chemicals, EIS electrochemical impedance spectroscopy, ERα estrogen receptor α, LBD ligand binding domain, RIFS reflectometric interference spectroscopy, TNT 2,4,6trinitrotoluene 以肽為分子識別物質(zhì)的生物分析法研究進展肽對于模仿發(fā)生在生物大分子（如酶、抗體、藥物受體）和跨膜蛋白中的分子識別機制[47–49]，是一個很好的選擇。鑒于這些原因設計了短的，基于肽的，能高特異性識別的人工受體，是生物技術(shù)的目標之一，以獲取競爭劑、抑制劑、藥物、親和純化系統(tǒng)試劑及生物傳感器中的活性元素[51]。曲曉剛[52]等報道了一種均相的熒光方法用于檢測多種蛋白酶，基于一個金納米粒子肽熒光團結(jié)合物作為基底（）。這個方法的“addmixmeasure”格式消除了冗長的納米探針加工，極大的減少了檢測時間，使它更有普遍性。然而，由于大多數(shù)肽與蛋白結(jié)合不容易產(chǎn)生一個測量的輸出信號，這嚴重的阻礙了使用肽作為檢測探針對蛋白的均相檢測。比使用SWNTs的好10倍，比最近報道的使用Tb3+螯合大環(huán)修飾p21(WAF1)肽的檢測限（）好1200倍。芘標記肽通過ππ相互作用和疏水作用牢牢的吸附在氧化石墨烯表面?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是血液中一個非常重要的生物標示物。緊接著通過蛋白酶作用，基質(zhì)在甘氨酸和纈氨酸之間的酰胺鍵處分裂，供體和受體分開，而富含π的基序（HHYY）繼續(xù)停留在受體上。 Schematic illustration (not to scale) of the MMP2 biosensor based on FRET from peptidelinked UCPs to CNPs 電化學方法電化學方法主要以電位、電流、電量或電導等電化學參數(shù)作為考察的對象，來研究溶液中被測物質(zhì)的電化學性質(zhì)及其變化。RA病人的血清中包含不同瓜氨酸肽和蛋白（如纖維蛋白或者絲聚蛋白）的抗體。通過與捐贈者的對照血清進行對比，該免疫傳感器用于檢測存在于RA病人血清中的抗CFFCP1抗體具有高選擇性和高靈敏度。固定聚（谷氨酸，酪氨酸）（4：1）肽在氧化銦錫（ITO）電極表面，通過層層組裝技術(shù)，利用鋨聯(lián)吡啶介導的酪氨酸氧化電流作為生物傳感器的信號輸出者（）。（主語）使用X射線光電子能譜定量測定了肽附著的電極表面氮元素的百分比，消除了由肽主鏈分裂引起的信號降低的可能性。在一次性絲網(wǎng)印刷金電極（SPGE）表面修飾金納米粒子（AuNPs）或者巰基化的單臂碳納米管/金納米粒子（SWCNT/AuNPs），隨后將巰基端二茂鐵抑胃酶肽自組裝在修飾過的電極表面。與化學發(fā)光相類似，ECL不需要使用外部光源。例如，此法能高靈敏地檢測亞皮摩爾濃度的釕聯(lián)吡啶（Ru(bpy)32+），線性范圍可達到大于六個數(shù)量級之寬。第三，它有可能電化學活化一些化合物成為能參與一個化學發(fā)光反應的物種，因此擴展了一個特定化學發(fā)光反應可檢測分析物的范圍。第五，它允許對ECL反應的時間進行較大的控制，從而提高了再現(xiàn)性，簡化操作。例如，ECL需要一種電化學設置和電極表面的頻繁更新，以確保良好的再現(xiàn)性。Ru(bpy)32+和它的類似物的ECL研究始于20世紀70年代。利用電化學發(fā)光可以檢測許多分析物，特別是含有氨的分析物，通過結(jié)合高效液相色譜（HPLC）、流動注射分析（FIA）、毛細管電泳（CE）和微觀全面分析體系(μTAS)，出現(xiàn)了一些新的電化學發(fā)光體系，使ECL的應用范圍更廣。當體系有足夠的能量時，發(fā)光過程被定義為按照單線路徑“S路徑”（方程（1） （3）），因為1A*將直接產(chǎn)生。例如，草酸根離子（C2O42）是發(fā)現(xiàn)的第一個共反應物。另一個“氧化還原”體系的例子是常見的Ru(bpy)32+/三丙胺（TPrA）體系，目前是商業(yè)ECL免疫分析和DNA分析的基礎。Ru(bpy)32+和TPrA在電極表面均被氧化，通過TPrA?還原Ru(bpy)33+產(chǎn)生激發(fā)態(tài)。在Scheme 4中，TPrA在電極上直接氧化產(chǎn)生TPrA?和TPrA?+。ECL強度的最大值大約發(fā)生在pH=，這非常適合應用于生物體系。漆紅蘭[64]等人報道了一種均相電化學發(fā)光免疫檢測方法用于檢測小分子物質(zhì)。兩個免疫檢測平臺，一個是直接的