【正文】 古霉素。第一個(gè)傳感器中，自組裝單層體現(xiàn)了一個(gè)固定化的，能模仿毒素的天然合作伙伴的熒光肽被聚集在金電極表面和陣列微流體通道接口處（）。由表面基質(zhì)毒素的分裂測(cè)量熒光強(qiáng)度，這個(gè)傳感器能檢測(cè)肉毒素A低至3 pg/mL，比要求的檢測(cè)限低十倍[25]。Fig. Sensor for Botulinum neurotoxin A (BoNT/A). A selfassembled monolayer (SAM) formation on gold yields mixed monolayers of amine and hydroxylterminated alkanethiols presenting the BoNT/A sensing peptide. B polydimethylsiloxane microchannels on 40 arrayed gold pads ( mm2)(scale bar 5 mm) with the image in the inset representing two neighboring channels (scale bar 1 mm). C BoNT/A is added at the input port and incubated on SAMs. Cleavage of the immobilized peptide substrate releases fluorescent fragments into solution. The fragments are concentrated at the detection port via evaporation.在第二個(gè)傳感器中，利用一個(gè)金涂層的石英晶體微天平檢測(cè)萬(wàn)古毒素（一種糖肽抗生素）的結(jié)合，一個(gè)包含DAlaDAla的肽固定化為一個(gè)穩(wěn)定和高度填充的自組裝單層，這是由于一個(gè)設(shè)計(jì)間隔的存在，還有多聚（乙二醇）單位來(lái)調(diào)節(jié)其極性（）。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，實(shí)時(shí)分析和樣品的無(wú)需標(biāo)記[26]。一個(gè)極高水平設(shè)計(jì)的復(fù)雜肽已被用于發(fā)展JR2EC和KE2C，一對(duì)42個(gè)氨基酸的合成肽[27]。由于大量負(fù)電荷的存在，肽在中性PH條件下是展開(kāi)的，然而在鋅離子存在時(shí)，羧基發(fā)生絡(luò)合作用，肽折疊成一個(gè)螺旋環(huán)螺旋構(gòu)象。折疊的肽聚集成一個(gè)二聚體卷曲，即使當(dāng)固定它們?cè)诮鸺{米粒子上時(shí)，也會(huì)因此原因而聚集。 萬(wàn)古毒素的結(jié)合模型Fig. Model of binding of vanycin to stable, wellpacked, and mixed SAMs presenting DAlaDAla (blue sticks). The mixed SAMs are linked by ligand 1 (a short ethylene glycol oligomer) and SAM ponent 3 (thiolipoic acid).如果在某種程度上設(shè)計(jì)肽的環(huán)區(qū)域結(jié)合目標(biāo)物，那么它的識(shí)別干擾聚集，金納米離子被轉(zhuǎn)向一個(gè)自由的形式，這與聚集的光譜特性差異很大（）。使用碳酸酐酶作為一個(gè)目標(biāo)物驗(yàn)證了這個(gè)概念，利用一個(gè)化學(xué)修飾肽，在肽的環(huán)上含有一個(gè)碳酸酐酶抑制劑的一部分[28]。 鋅離子促進(jìn)螺旋環(huán)螺旋的折疊允許納米粒子聚集，目標(biāo)物的識(shí)別使平衡向分散納米粒子的方向移動(dòng)Fig. Zn2+promoted folding of helix–loop–helix peptides allows nanoparticle aggregation. Recognition of the target shifts the equilibrium towards dispersed nanoparticles.設(shè)計(jì)的肽因此成為發(fā)展離子、小分子甚至蛋白傳感器的強(qiáng)大工具，并在裝置的傳感表面引進(jìn)高層次的組織。然而，天然肽基序幾乎代表了獨(dú)一無(wú)二的設(shè)計(jì)靈感來(lái)源：肽結(jié)合基序和肽自組織基序源于類(lèi)似的蛋白質(zhì)相互作用的理論。主要缺點(diǎn)在于全人工設(shè)計(jì)肽的理論方法這個(gè)巨大的困難仍然需要克服。在硅片上設(shè)計(jì)一個(gè)能夠結(jié)合選定目標(biāo)的肽需要反復(fù)地優(yōu)化目標(biāo)函數(shù)（例如，結(jié)合力），根據(jù)不同于它們主序列的候選肽庫(kù)。盡管這些方法已經(jīng)取得了重大成就，但計(jì)算的和實(shí)驗(yàn)的蛋白設(shè)計(jì)仍然存在嚴(yán)重的技術(shù)問(wèn)題。首先，在一個(gè)固定的支架上嵌入一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)導(dǎo)致了一個(gè)合適的候選者，只要蛋白支架就算突變?nèi)匀荒鼙３炙姆€(wěn)定性。然而，穩(wěn)定的支架一般大，難以大量合成或表達(dá)。此外，在計(jì)算方法上，人們不得不應(yīng)付與突變空間有關(guān)的組合爆炸：如果你沿著肽序列選擇十個(gè)假定的突變位點(diǎn)，那么可能的組合數(shù)將考慮為1020個(gè)。在噬菌體展示肽中，其特性(如識(shí)別和結(jié)合)是與基因編碼它的基本序列相關(guān)的。噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，作為外源DNA鏈的表達(dá)載體，將被感染宿主表達(dá)為一個(gè)肽。噬菌體展示外源基因插入一個(gè)噬菌體外殼蛋白基因，所需的氨基酸序列與內(nèi)源基因融合，產(chǎn)生一個(gè)雜交融合蛋白。當(dāng)它們從細(xì)胞中釋放時(shí)，這個(gè)雜交的外殼蛋白隨即被納入噬菌體微粒，肽被展示在病毒粒子上（）[29]。噬菌體展示庫(kù)含有多達(dá)109個(gè)不同的噬菌體克隆元素，每個(gè)通過(guò)隨機(jī)的基因序列產(chǎn)生一個(gè)不同的肽。粘合劑肽的選擇通過(guò)包含展示肽和一個(gè)固定化的目標(biāo)物的一個(gè)必要結(jié)合事件的文庫(kù)，允許來(lái)自于文庫(kù)中表現(xiàn)最佳的粘合劑的物理分離。在噬菌體上的融合表達(dá)蛋白和目標(biāo)物的固定體系均能影響結(jié)合事件。 肽噬菌體展示的循環(huán)用于結(jié)合肽的選擇Fig. The cycle of peptide phage display for the selection of binder peptides.如果目標(biāo)物是小分子，這也許就表現(xiàn)出了方法的主要缺點(diǎn)。通常在一個(gè)小的有機(jī)目標(biāo)分子（例如一種藥物）中發(fā)現(xiàn)的是極少數(shù)的官能團(tuán)，它們中的每一個(gè)也許提供一個(gè)和潛在受體的基本相互作用點(diǎn)。如此官能團(tuán)的修飾引進(jìn)了連接器，它也許比目標(biāo)物自身更大。生物素常常被發(fā)現(xiàn)在連接器端，允許固定在抗生物素蛋白涂層的表面。如果目標(biāo)物展示在抗生物素生物素表面，與連接器甚至與抗生物素蛋白的交叉反應(yīng)，往往是一個(gè)問(wèn)題。選擇肽粘合劑是相當(dāng)困難的，肽粘合劑能區(qū)分固定化和自由存在的目標(biāo)物，如先前報(bào)道的抗睪酮和抗甲氨蝶呤肽的選擇[30，31]。噬菌體展示小分子連接困難的一個(gè)典型的例子是2，4，6 三硝基甲苯（TNT）的生物傳感器的發(fā)展[32]。為了允許固定，TNT的甲基被一個(gè)苯磺酸基取代，適用于通過(guò)磺酰胺鍵的形成共價(jià)連接載體蛋白。所有已選定的很強(qiáng)的粘合劑共享一個(gè)精氨酸組氨酸共識(shí)對(duì)子（一個(gè)雙配位基陽(yáng)離子和一個(gè)氫鍵受體協(xié)同識(shí)別硝基）：這被認(rèn)為是來(lái)自于文庫(kù)的一個(gè)正確的結(jié)合響應(yīng)，同樣的，免疫系統(tǒng)和雙配位基陰離子也以非常類(lèi)似的方式反應(yīng)[33]。然而，使用已選定肽在熒光流量傳感器中的檢測(cè)限高達(dá)12 mg/ml，最可能是由于肽無(wú)法識(shí)別未改變的、自由的TNT。鄰近的許多肽分子展示在噬菌體衣殼上可能導(dǎo)致多價(jià)靶結(jié)合：一個(gè)四肽粘合劑通過(guò)噬菌體展示被選定用于一個(gè)卟啉目標(biāo)物，但有兩個(gè)肽分子涉及到π堆積，與單個(gè)的卟啉分子相互作用[34]。通過(guò)連接在石英晶體微天平（QCM）上的鄰近肽分子在多價(jià)乳膠（聚苯乙烯）珠上的再生使肽被更好的利用。然而，使用噬菌體展示的主要優(yōu)點(diǎn)在于許多粘合劑肽的產(chǎn)生來(lái)自于完全隨機(jī)文庫(kù)，都不包含任何肽結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)的元素[3537]。非設(shè)計(jì)肽庫(kù)也許可提供能夠區(qū)分目標(biāo)物之間的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異，甚至不同構(gòu)象的肽。一個(gè)基于反射干涉光譜的無(wú)標(biāo)記和時(shí)間分辨?zhèn)鞲衅骼檬删w展示選擇的肽探測(cè)了內(nèi)雌激素受體α結(jié)合各種配體的構(gòu)象變化[38]。選定一個(gè)噬菌體展示肽庫(kù)對(duì)同一受體的兩種形式，產(chǎn)生了兩種不同的粘合劑肽，能夠區(qū)分不同的構(gòu)象。固定生物素化的肽α/β在傳感器表面，與高或低親和力的雌性激素α相互作用，這取決于受體構(gòu)象中存在的激動(dòng)劑或拮抗劑[39]。利用隨機(jī)噬菌體展示肽發(fā)展起來(lái)的生物傳感器系統(tǒng)的匯集如表2所示。盡管目標(biāo)物的高多樣性，其中包括整個(gè)細(xì)胞，蛋白質(zhì)，有機(jī)小分子，所有的體系報(bào)道在表2中，已從市面上可買(mǎi)到的噬菌體展示隨機(jī)肽文庫(kù)中獲得，不需要任何一種設(shè)計(jì)，不需要生物學(xué)操作的復(fù)雜階段，有必要用于發(fā)展單克隆抗體。這顯然是隨機(jī)噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，成本低，易于標(biāo)準(zhǔn)化。原則上，對(duì)于任何一種目標(biāo)物，可以嘗試摸索出來(lái)自同一商業(yè)文庫(kù)的肽受體，然而結(jié)果是相當(dāng)難以預(yù)測(cè)的，肽的性能可能比抗體好很多[40，43]，或者也許差很遠(yuǎn)[32，45]。 基于隨機(jī)噬菌體展示肽傳感器Table Sensors based upon random phage display peptidesReferenceTargetSensing peptideSensorSensitivity[40]Murine myofibers7mer ASSLNIAAcoustic waveMurine skeletal proteins 10 μg/ml, apparent Kd 280 μg/ml Fast response (100 s), whereas a similar, antibodybased sensor shows 100min equilibration time[41]Ps. Aeruginosa wholecells9mer QRKLAAKLT resembling thesequence of natural CPPQCM[42]SW620 metastatic cells12merPotentiometric100 cells/ml blood[43]Anthrax protectiveantigen16mer HKHAHNYRLPASGGGKKSquare wave voltammetriKd pM, dynamic range 4–120 pM, LOD pM[44]Enterotoxin B12merFiber optical. The RAPTOR optical probe was used[41]Dynamic range 1031 μg/well, LOD 103 μg/well[45]Cardiac troponin I12mer FYSHSFHENWPSQCM and EISQCM: dynamic range μg/ml, LOD μg/ml EIS: LOD μg/ml[46]Streptavidin12mer from filamentous R5C2 phagesOptofluidic ring resonatorLOD 100 pM, apparent Kd 25 pM[31]Methotrexate11mer SIFPLCNSGAL selected directly on a QCM deviceQCM and SPRRange 2–50 μM, Kd μM[32]TNT12mers sharing a HR consensus dyadFluorimetric flow sensorDynamic range 6–100 mg/ml, LOD mg/ml[34]Porphyrin5mer HASYS peptide immobilized on latex beads to allow 2:1 peptidetotarget plex formationQCMDynamic range μg/ml, LOD μg/ml[39]EDCsPeptide α/β IRIFSERαLBD 100μg/mL incubated with 10 μg/mL βestradiol and with 10 μg/mL tamoxifen Discrimination between agonists and antagonists of ERαCPP cellpenetrating peptide, EDCs endocrinedisrupting chemicals, EIS electrochemical impedance spectroscopy, ERα estrogen receptor α, LBD ligand binding domain, RIFS reflectometric interference spectroscopy, TNT 2,4,6trinitrotoluene 以肽為分子識(shí)別物質(zhì)的生物分析法研究進(jìn)展肽對(duì)于模仿發(fā)生在生物大分子（如酶、抗體、藥物受體）和跨膜蛋白中的分子識(shí)別機(jī)制[47–49]，是一個(gè)很好的選擇。這些大分子通過(guò)和目標(biāo)分子結(jié)合位點(diǎn)的多重相互作用產(chǎn)生了高的特異性或高的催化活性，弄清楚結(jié)合或者催化的控制與產(chǎn)生人工宏觀識(shí)別的機(jī)制，這需要相當(dāng)大的努力。嗅覺(jué)受體蛋白作為一個(gè)例子已經(jīng)進(jìn)行了重要的研究[50]。這些非常復(fù)雜的分子很難從自然資源中純化，也不可能合成，但它們具體應(yīng)用的可用性將是十分寶貴的。鑒于這些原因設(shè)計(jì)了短的，基于肽的，能高特異性識(shí)別的人工受體，是生物技術(shù)的目標(biāo)之一，以獲取競(jìng)爭(zhēng)劑、抑制劑、藥物、親和純化系統(tǒng)試劑及生物傳感器中的活性元素[51]。肽用于設(shè)計(jì)人工受體是一個(gè)極好的代表，那是因?yàn)椋海?）通過(guò)連接21個(gè)天然氨基酸，能獲得不同分子數(shù)量的肽；（2）分子生物學(xué)和化學(xué)工藝都可用于肽庫(kù)的快速篩選；（3）合成的自動(dòng)化，低成本可用于制備大量高純度的肽；（4）易于修飾進(jìn)一步提高了它的結(jié)合力；（5）相對(duì)容易建模。大量生物模擬，基于肽的傳感系統(tǒng)已在近年來(lái)的文獻(xiàn)中報(bào)道，檢測(cè)方法大多為熒光和電化學(xué)方法。 熒光光譜法熒光光譜法是以物質(zhì)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性關(guān)系為依據(jù)進(jìn)行的定量分析，以熒光光譜的形狀和熒光峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行的定性分析，因其具有靈敏度高，樣品用量少，選擇性強(qiáng)，信息多樣，方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域中。曲曉剛[52]等報(bào)道了一種均相的熒光方法用于檢測(cè)多種蛋白酶，基于一個(gè)金納米粒子肽熒光團(tuán)結(jié)合物作為基底