【正文】 學發(fā)光免疫分析法無需洗滌、分離等步驟，操作簡單，可實現(xiàn)自動化等優(yōu)點在臨床上受到人們的廣泛關注。大部分均相電化學發(fā)光免疫分析方法檢測蛋白基于抗原抗體免疫結(jié)合引起電化學發(fā)光強度的降低[1721]。Ikariyama報道了一種利用芘標記人血清白蛋白(HSA)作為信號探針，檢測HSA抗體和HSA的均相電化學發(fā)光免疫分析[18]。徐等建立了一種均相電化學發(fā)光免疫分析，通過利用釕聯(lián)吡啶衍生物標記血清PSA的分子形式，檢測PSA[20]。我們實驗室利用魯米諾和釕聯(lián)吡啶作為電化學發(fā)光信號，BSA作為載體蛋白，設計了一種檢測地高辛的均相電化學發(fā)光免疫分析[21]。然而，在這些免疫檢測中，具有大分子量的信號探針在和相應的目標物作用時，信號改變較小，且檢測需要多個步驟及很長的孵育時間。此外，抗體在生產(chǎn)，穩(wěn)定性和操作方面的缺陷不得不讓研究者尋找新的替代物[22]。因此，尋找一種簡單、靈敏、無需分離的方法用于檢測蛋白是免疫分析技術所面臨的一個長期的目標。生物檢測中最關鍵的部分可能就是分子識別元件（如抗體，適體，酶，核酸，受體等）[23]。近來，利用噬菌體展示技術獲得的肽，作為抗體的替代物，具有自身的優(yōu)點，如容易合成，穩(wěn)定性好，極強的生物活性和多樣性，且具有分子量小，易于改造，價格低廉，可在極端條件下使用，無毒副作用等優(yōu)點，在生物檢測方面得到廣泛的關注[24，25]。已報道了以肽為分子識別物質(zhì)的生物傳感器用于心肌肌鈣蛋白I(cTnI)[2526]，前列腺特異性抗原(PSA)[2728]，蛋白激酶[29]，HIV[3031]，細菌[32]等的分析檢測，獲得了滿意的結(jié)果?；诖?，我們提出了一種以肽為分子識別物質(zhì)檢測cTnI的高靈敏高選擇性的均相電化學發(fā)光方法。選擇cTnI作為目標蛋白，肽(FYSHSFHENWPSK)作為分子識別元件。Park識別了這個對人類cTnI有納摩爾親和力和特異性的肽(FYSHSFHENWPSK)[25]。肽(FYSHSFHENWPSK)有幾個疏水的氨基酸和幾個絲氨酸，這表明氫鍵和疏水作用有利于cTnI的結(jié)合[33]。這個序列包含一個色氨酸（W）繼之以脯氨酸（P），這也許引起了一個能有效和目標物結(jié)合的結(jié)構(gòu)的扭曲[3435]。電化學發(fā)光信號物質(zhì)釕聯(lián)吡啶衍生物(Ru(bpy)2(dcbpy)NHS)標記肽(FYSHSFHENWPSK)形成Ru肽探針。當不存在目標物cTnI時，信號物質(zhì)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS游離在溶液中產(chǎn)生強的電化學發(fā)光信號；存在目標物cTnI時，探針與cTnI結(jié)合形成復合物，電化學發(fā)光強度降低。通過電化學發(fā)光信號的降低進行目標物cTnI的檢測。此外，利用電化學方法驗證了電化學發(fā)光信號降低的原因。 實驗部分 儀器與試劑肽（FYSHSFHENWPSK， MW=），純度大于95%，廣州特立生物科技有限公司（中國）合成；心肌肌鈣蛋白I（cTnI，人類心臟）購自Abcam公司（劍橋，英國），人類甲胎蛋白（AFP）購自Fitzgerald Industries International公司（美國），人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）購自北京博奧森生物技術有限公司（中國），雞蛋白蛋白購自中美生物技術有限公司（中國），其它試劑均為分析純，實驗所用溶液均用Millipore Milli Q（ WM）水配制。電化學發(fā)光測量過程用MPIE型電化學發(fā)光儀（西安瑞邁電子公司，中國）進行檢測。25 cm25 cm稱量瓶用來作為電化學發(fā)光的檢測池。該體系為傳統(tǒng)的三電極體系：玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，飽和Ag/AgCl作為參比電極。檢測時光電倍增管(PMT)的高壓為900，除非另外的聲明。電化學測量過程使用CHI 660電化學工作站（上海辰華儀器公司，中國）。Fig. Schematic diagram of homogeneous peptidebased ECL method for determination of cTnI. 電化學發(fā)光探針的制備釕聯(lián)吡啶衍生物標記肽（Ru肽）探針的制備 [22，36]：1mg肽( mmol)溶解于100 μL無水乙醇中。在攪拌的情況下加入摩爾量過量10倍的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS后過夜孵育。將標記混合物以100mM pH = PBS作為透析液，通過透析袋（截留分子量 2000）進行純化。Ru肽溶液的濃度根據(jù)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS在457 105 M[3738]。 電化學發(fā)光檢測cTnI將不同濃度的cTnI與固定濃度的Ru肽混合孵育1h之后，50 mM mol/L PBS (pH )緩沖溶液中，恒電位+ V下檢測。通過電化學發(fā)光強度的降低值(△I= I0 –IS)來定量cTnI的濃度，IS是Ru肽與cTnI作用之后的電化學發(fā)光強度值，I0是Ru肽的電化學發(fā)光空白值。 結(jié)果與討論 電化學發(fā)光探針的表征首先對制備的電化學發(fā)光探針（Ru肽）利用紫外可見光譜以及電化學發(fā)光技術進行表征。， nm， 287 nm 和457 nm處（線b），而肽的特征吸收峰在280nm處（線a），Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的特征吸收峰在245 nm， 287 nm 和 457 nm處（線c）。這表明Ru(bpy)2(dcbpy)NHS已標記在肽上。(bpy)2(dcbpy)NHS（線a）和Ru肽（線b）在50 mM mol/L PBS (pH )溶液中的電化學發(fā)光強度電位圖。Ru肽表現(xiàn)出了和Ru(bpy)2(dcbpy)NHS類似的電化學發(fā)光行為，進一步確定Ru(bpy)2(dcbpy)NHS已經(jīng)標記在肽上。曲線a和曲線b相比，在相同的濃度下，Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的電化學發(fā)光強度比Ru肽的高2倍多。這也許是因為Ru肽分子量的增加，導致了擴散系數(shù)的降低[1921]，這將在下文被進一步討論。 電化學發(fā)光探針對cTnI的電化學發(fā)光響應本工作中，我們使用一個序列為FYSHSFHENWPSK的肽為分子識別物質(zhì)。通過?；磻猂u(bpy)2(dcbpy)NHS與肽右端賴氨酸（K）上的氨基共價連接，制得電化學發(fā)光肽探針。本實驗基于Ru肽與蛋白結(jié)合前后，電化學發(fā)光信號的變化，進行肌鈣蛋白的分析檢測。為了驗證該方法的可行性，在存在和不存在目標蛋白時考察了電化學發(fā)光探針的電化學發(fā)光動力學。109g/mL cTnI 和 108g/mL cTnI作用前后的電化學發(fā)光動力學圖。曲線a和曲線b比較，可以看到Ru肽有一個高的電化學發(fā)光信號（a，7309），109g/mL cTnI作用之后的電化學發(fā)光信號相對較低（b，5550）。曲線b和曲線c相比，可以看到隨著cTnI濃度的增加，電化學發(fā)光強度從5550下降到2612。這些都表明cTnI與Ru肽的結(jié)合極大抑制了Ru肽的電化學發(fā)光強度。 （A）肽，釕聯(lián)吡啶衍生物標記肽（Ru肽）以及釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru）的紫外可見光譜圖 （B）釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru）及釕聯(lián)吡啶衍生物標記肽（Ru肽）的電化學發(fā)光圖Fig. (A) UVVis spectra of peptide (a), Rupeptide (b) and Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (c)。 (B) ECL intensitypotential profiles of 108 M Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (a) and 108 M Rupeptide (b) in M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. Scan rate, 50 mV/s.為了研究電化學發(fā)光強度降低的原因，我們利用電化學方法考察Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，Ru肽及Ru肽蛋白的擴散系數(shù)[39]。利用計時電流法在一個鉑超微電極（UME）。你需要寫出具體的公式，和參考文獻，你真翻譯英語了呀，你就不會把句子寫的通順點圖中的截距均接近于1。截距和線性相關性與在一個相當短的時間區(qū)域內(nèi)的理論預測較好的吻合。Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，105 cm2/s， 107 cm2/s 及 108 cm2/s（根據(jù)斜率((2/π3/2)aD1/2計算，a是微電極的半徑)。 電化學發(fā)光探針與不同濃度心肌肌鈣蛋白I結(jié)合前后的電化學發(fā)光圖Fig. ECL kinetic profiles of the 108 M ECL probe before (a) and after reacted with 109g/mL cTnI (b) and 108 g/mL cTnI (c). Experimental condition: binding time, 60 min。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA。 applied potential, V. 釕聯(lián)吡啶衍生物肽（上，a）及釕聯(lián)吡啶衍生物肽蛋白（下，b）的氧化作用圖Fig. Plot of the experimental ratio it/id,ss against the inverse square root of time in M PBS with 10 μm radius Pt UME. (a) Oxidation at step potential ESP = + V vs SCE for 106 M Rupeptide, (b) Oxidation at step potential ESP = + V vs SCE for 106 M Rupeptideprotein conjugate.在此之前，研究了Ru(bpy)2(dcbpy)NHS在鉑超微電極上的線性掃描伏安，可以看到一個很好的氧化峰。Park已經(jīng)報道了肽和cTnI的結(jié)合[25]。肽和cTnI的結(jié)合導致了分子量的增加，擴散系數(shù)的降低，進而導致了電化學發(fā)光強度的降低，這與文獻[17，20]中所報道的類似。 鉑超微電極在釕聯(lián)吡啶溶液中的循環(huán)伏安圖Fig. Cyclic voltammogram of 1 mM Ru(bpy)2(dcbpy)NHS in M PBS with 10 μm radius Pt ultramicroelectrode. Scan rate = 50 mV/s. 實驗條件的優(yōu)化考察電位對電化學發(fā)光強度的影響，結(jié)果表明當施加的電位從++，電化學發(fā)光信號逐漸增大，且在+。因而，實驗中選擇+。我們研究了Ru肽與cTnI的結(jié)合時間對電化學發(fā)光信號的影響，發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)合時間的增加，電化學發(fā)光信號降低。因而，Ru肽與cTnI的結(jié)合時間通過調(diào)查cTnI引起的電化學發(fā)光強度的降低來獲得最佳結(jié)合時間。108 g/mL cTnI混合不同的時間，含有50mM 。結(jié)果可以看到，隨著結(jié)合時間從20min增加到60min，電化學發(fā)光強度逐漸降低，60min以后穩(wěn)定（）。這表明60min足夠使體系達到平衡。因此，本實驗選擇60min作為最佳結(jié)合時間。 電位的選擇Fig. Dependence of the ECL intensity of the 108 M ECL probe on applied potential. Experimental condition: binding time, 60 min。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 結(jié)合時間的選擇Fig. Dependence of the ECL intensity of the 108 M ECL probe on the binding time with 108g/mL condition: applied potential, + V。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 線性范圍和檢出限在優(yōu)化的實驗條件下。， 隨著cTnI濃度的增加，電化學發(fā)光強度降低。1010 g/mL ~ 108 g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系， 線性方程為△I = 2250lgC + (C的單位是1010 g/mL)，1010g/mL。當心肌疾病發(fā)生的時候，血清中cTnI的含量在5到50ng/mL[40]，因此，這個方法足以用來檢測臨床樣品中的cTnI。109 g/mL %。 釕聯(lián)吡啶衍生物標記肽（Ru肽）與不同濃度的心肌肌鈣蛋白I相互作用的電化學發(fā)光響應Fig. ECL responses of the 108 M Rupeptide reacted with different concentrations of cTnI. (a) 1010g/mL, (b) 109g/mL, (c) 109g/mL, (d)108g/mL, (e) 108g/mL, (f) 108g/mL. Insert, calibration curve of cTnI. Experimental condition: binding time, 60 min。 applied potential, + V。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 選擇性 109 M的cTnI (108 g/mL)、IgG、BSA、AFP、雞蛋白蛋白結(jié)合后電化學發(fā)光信號的變化，考察電化學發(fā)光探針的選擇性。，電化學發(fā)光探針與cTnI作用后電化學發(fā)光值顯著降低(43%)，% (IgG)、% (BSA )、% (AFP ) 、% (雞蛋白蛋白)。這表明Ru肽探針對cTnI有好的選擇性。（Ru肽）探針對心肌肌鈣蛋白I的選擇性Fig. ECL responses of the 108 M Rupeptide reacted with 109 M cTnI, 109 M IgG, 109 M BSA, 109 M AFP and 109 M alb