【正文】 這表明Ru肽探針對cTnI有好的選擇性。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 選擇性 109 M的cTnI (108 g/mL)、IgG、BSA、AFP、雞蛋白蛋白結(jié)合后電化學(xué)發(fā)光信號的變化，考察電化學(xué)發(fā)光探針的選擇性。 釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記肽（Ru肽）與不同濃度的心肌肌鈣蛋白I相互作用的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)Fig. ECL responses of the 108 M Rupeptide reacted with different concentrations of cTnI. (a) 1010g/mL, (b) 109g/mL, (c) 109g/mL, (d)108g/mL, (e) 108g/mL, (f) 108g/mL. Insert, calibration curve of cTnI. Experimental condition: binding time, 60 min。當(dāng)心肌疾病發(fā)生的時候，血清中cTnI的含量在5到50ng/mL[40]，因此，這個方法足以用來檢測臨床樣品中的cTnI。 隨著cTnI濃度的增加，電化學(xué)發(fā)光強度降低。 detection solution, M PBS (pH ) containing 50 mM TPA. 結(jié)合時間的選擇Fig. Dependence of the ECL intensity of the 108 M ECL probe on the binding time with 108g/mL condition: applied potential, + V。因此，本實驗選擇60min作為最佳結(jié)合時間。結(jié)果可以看到，隨著結(jié)合時間從20min增加到60min，電化學(xué)發(fā)光強度逐漸降低，60min以后穩(wěn)定（）。因而，Ru肽與cTnI的結(jié)合時間通過調(diào)查cTnI引起的電化學(xué)發(fā)光強度的降低來獲得最佳結(jié)合時間。因而，實驗中選擇+。肽和cTnI的結(jié)合導(dǎo)致了分子量的增加，擴散系數(shù)的降低，進而導(dǎo)致了電化學(xué)發(fā)光強度的降低，這與文獻[17，20]中所報道的類似。 applied potential, V. 釕聯(lián)吡啶衍生物肽（上，a）及釕聯(lián)吡啶衍生物肽蛋白（下，b）的氧化作用圖Fig. Plot of the experimental ratio it/id,ss against the inverse square root of time in M PBS with 10 μm radius Pt UME. (a) Oxidation at step potential ESP = + V vs SCE for 106 M Rupeptide, (b) Oxidation at step potential ESP = + V vs SCE for 106 M Rupeptideprotein conjugate.在此之前，研究了Ru(bpy)2(dcbpy)NHS在鉑超微電極上的線性掃描伏安，可以看到一個很好的氧化峰。 電化學(xué)發(fā)光探針與不同濃度心肌肌鈣蛋白I結(jié)合前后的電化學(xué)發(fā)光圖Fig. ECL kinetic profiles of the 108 M ECL probe before (a) and after reacted with 109g/mL cTnI (b) and 108 g/mL cTnI (c). Experimental condition: binding time, 60 min。截距和線性相關(guān)性與在一個相當(dāng)短的時間區(qū)域內(nèi)的理論預(yù)測較好的吻合。利用計時電流法在一個鉑超微電極（UME）。 （A）肽，釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記肽（Ru肽）以及釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru）的紫外可見光譜圖 （B）釕聯(lián)吡啶衍生物（Ru）及釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記肽（Ru肽）的電化學(xué)發(fā)光圖Fig. (A) UVVis spectra of peptide (a), Rupeptide (b) and Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (c)。曲線b和曲線c相比，可以看到隨著cTnI濃度的增加，電化學(xué)發(fā)光強度從5550下降到2612。109g/mL cTnI 和 108g/mL cTnI作用前后的電化學(xué)發(fā)光動力學(xué)圖。本實驗基于Ru肽與蛋白結(jié)合前后，電化學(xué)發(fā)光信號的變化，進行肌鈣蛋白的分析檢測。 電化學(xué)發(fā)光探針對cTnI的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)本工作中，我們使用一個序列為FYSHSFHENWPSK的肽為分子識別物質(zhì)。曲線a和曲線b相比，在相同的濃度下，Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的電化學(xué)發(fā)光強度比Ru肽的高2倍多。(bpy)2(dcbpy)NHS（線a）和Ru肽（線b）在50 mM mol/L PBS (pH )溶液中的電化學(xué)發(fā)光強度電位圖。 nm， 287 nm 和457 nm處（線b），而肽的特征吸收峰在280nm處（線a），Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的特征吸收峰在245 nm， 287 nm 和 457 nm處（線c）。通過電化學(xué)發(fā)光強度的降低值(△I= I0 –IS)來定量cTnI的濃度，IS是Ru肽與cTnI作用之后的電化學(xué)發(fā)光強度值，I0是Ru肽的電化學(xué)發(fā)光空白值。Ru肽溶液的濃度根據(jù)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS在457 105 M[3738]。在攪拌的情況下加入摩爾量過量10倍的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS后過夜孵育。電化學(xué)測量過程使用CHI 660電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司，中國）。該體系為傳統(tǒng)的三電極體系：玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，飽和Ag/AgCl作為參比電極。電化學(xué)發(fā)光測量過程用MPIE型電化學(xué)發(fā)光儀（西安瑞邁電子公司，中國）進行檢測。此外，利用電化學(xué)方法驗證了電化學(xué)發(fā)光信號降低的原因。當(dāng)不存在目標(biāo)物cTnI時，信號物質(zhì)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS游離在溶液中產(chǎn)生強的電化學(xué)發(fā)光信號；存在目標(biāo)物cTnI時，探針與cTnI結(jié)合形成復(fù)合物，電化學(xué)發(fā)光強度降低。這個序列包含一個色氨酸（W）繼之以脯氨酸（P），這也許引起了一個能有效和目標(biāo)物結(jié)合的結(jié)構(gòu)的扭曲[3435]。Park識別了這個對人類cTnI有納摩爾親和力和特異性的肽(FYSHSFHENWPSK)[25]?；诖?，我們提出了一種以肽為分子識別物質(zhì)檢測cTnI的高靈敏高選擇性的均相電化學(xué)發(fā)光方法。近來，利用噬菌體展示技術(shù)獲得的肽，作為抗體的替代物，具有自身的優(yōu)點，如容易合成，穩(wěn)定性好，極強的生物活性和多樣性，且具有分子量小，易于改造，價格低廉，可在極端條件下使用，無毒副作用等優(yōu)點，在生物檢測方面得到廣泛的關(guān)注[24，25]。因此，尋找一種簡單、靈敏、無需分離的方法用于檢測蛋白是免疫分析技術(shù)所面臨的一個長期的目標(biāo)。然而，在這些免疫檢測中，具有大分子量的信號探針在和相應(yīng)的目標(biāo)物作用時，信號改變較小，且檢測需要多個步驟及很長的孵育時間。徐等建立了一種均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析，通過利用釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記血清PSA的分子形式，檢測PSA[20]。大部分均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測蛋白基于抗原抗體免疫結(jié)合引起電化學(xué)發(fā)光強度的降低[1721]。因此，建立一種制備步驟極少，但仍然具有高靈敏度，值得信賴的方法，是分析化學(xué)家們追求的目標(biāo)。Smith等建立了一種檢測鼠血清中的cTnI的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器[13]。電化學(xué)發(fā)光方法由于其具有的高靈敏度，快速檢測及容易控制[1416]等優(yōu)點成為蛋白生物檢測的通用方法。這些檢測方法都有自身的優(yōu)點和缺點。心肌肌鈣蛋白I (cTnI)，分子量為24kDa，是存在于心肌組織中的肌鈣蛋白復(fù)合體的一部分，已成為選擇用于檢測心肌損傷的一個可信賴的生物標(biāo)記物[12]。在金電極上同時檢測博來霉素和PSA，發(fā)展了一種OR邏輯門，進行博來霉素和PSA的同時檢測可行性的研究。以肽（CHSSLKQK）作為分子識別物質(zhì)，釕聯(lián)吡啶衍生物作為信號物質(zhì)，構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，進行PSA的分析檢測。以能夠特異性結(jié)合cTnI的肽（FYSHSFHENWPSK）作為分子識別物質(zhì)，釕聯(lián)吡啶衍生物作為信號物質(zhì)，建立檢測cTnI的均相電化學(xué)發(fā)光分析方法。以肽作為分子識別物質(zhì)，釕聯(lián)吡啶衍生物為信號物質(zhì)，建立簡單、靈敏的檢測疾病標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光分析方法。目前，未檢索到以肽為分子識別物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光分析方法。目前報道的方法大部分為熒光光譜法和電化學(xué)方法。另外，基于適體的生物傳感器是高度可重復(fù)使用的（RSD = %，n=7），具有長期的儲存穩(wěn)定性（%）?；谶m體的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，它對于可卡因有一個極低的檢測限為10pM，對于可卡因、海洛因及咖啡因提供了一個好的選擇性。三丙胺（TPrA）和胃復(fù)安（MCP）作為模 電化學(xué)發(fā)光適體傳感器檢測凝血酶和ATP的設(shè)計原理圖Fig. Schematic description of the ECL aptasensor for human thrombin and ATP based upon the amplification of biobarcode method.Figure Schematic diagram of the fabrication of ECL chemical sensor and ECL aptamerbased biosensor for cocaine detection.型分析物評估了該化學(xué)傳感器的性能。 凝血酶適體傳感器的設(shè)計原理圖Fig. Design of thrombin aptasensor. (A) GNPs were taken as a capture probe carrier. (B) SWNT was taken as a signal probe carrier.張成孝[72]研究小組報道了一種高靈敏和可重復(fù)使用的電化學(xué)發(fā)光化學(xué)傳感器用于檢測三丙胺及一種基于適體的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于檢測可卡因。該工作展示了人類凝血酶和ATP的檢測限各自分別為1pM和10pM，具有高的特異性。通過利用兩個親和適體的高特異性三明治結(jié)合，釕聯(lián)吡啶（TBR）半胱胺負(fù)載在金納米粒子上，金納米粒子用于信號放大，基于電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的微磁性粒子（MMPs）用于快速檢測，建立了一個新的生物分子的定量檢測。邢達[71]等建立了一種有前景的適體傳感器用于高靈敏檢測蛋白和小分子，基于構(gòu)建的適體修飾的電化學(xué)發(fā)光納米探針。1011M范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢測限為31015M。109M范圍內(nèi)成比例關(guān)系，檢測限為81013M。在“signal off”型適體傳感器中，巰基捕獲探針（ssDNA，12mer）自組裝在金納米粒子上，金納米粒子自組裝在金電極表面，與包含標(biāo)記釕復(fù)合物的TBAⅠ（ssDNA，15mer）的單鏈DNA序列（Tgt適體，21mer）的六個堿基段雜交之后，產(chǎn)生一個高的電化學(xué)發(fā)光強度。電化學(xué)發(fā)光強度與AFP在兩個濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系。因而，抗AFP作為一個模型通過靜電和物理吸附固定在這個傳感界面。證明了碳納米點萘酚納米復(fù)合膜促進了魯米諾的電子轉(zhuǎn)移速率，導(dǎo)致了更好的電化學(xué)活性，提高了電化學(xué)發(fā)光性能。陳國南[69]研究小組提出了一種簡單和高度靈敏的基于一鍋合成碳納米點和萘酚復(fù)合膜的納米復(fù)合材料的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，用于檢測甲胎蛋白（AFP）。檢測限為91011M。存在目標(biāo)單鏈DNA時，由于雜交，電極表面電化學(xué)發(fā)光探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€線性的雙螺旋構(gòu)型，導(dǎo)致標(biāo)記物遠離電極表面，電化學(xué)發(fā)光信號降低。
電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器制作原理圖Fig. Schematic representation of the fabrication of the ECL immunosensor. (a) GCE deposited with AuNPs, (b) AuNPs/cysteine, (c) AuNPs/cysteine/GLD + Ab1, (d) after blocking with BSA, (e) (d) + CEA, (f) (e) + RusilicaNPG labeled Ab2.張成孝[68]等設(shè)計了一種高選擇性電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于檢測目標(biāo)單鏈DNA，使用發(fā)夾DNA做為識別元素，釕復(fù)合物作為信號物質(zhì)。 獲得的CEA的濃度在1pg/mL到10ng/mL范圍內(nèi)， pg/mL。納米金的制備通過一個簡單的脫合金成分腐蝕，銀/金合金中的銀在硝酸中被選擇性溶解。 非均相電化學(xué)發(fā)光分析余京華[67]等報道了一種簡單和靈敏的夾心型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，在一個金納米粒子修飾的玻碳電極上檢測癌胚抗原（CEA）。1010g/%（n=11）。發(fā)現(xiàn)在金納米粒子修飾的石蠟浸漬的石墨電極上異魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度在中性水溶液存在過氧化氫時顯著的增大，異魯米諾的檢測限是21014mol/L（S/N=3）。異魯米諾標(biāo)記抗hIgG抗體產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光強度在hIgG抗原存在時，顯著的增大，這是由于異魯米諾形成了一個更加剛性的結(jié)構(gòu)。在檢測中沒有觀察到其它的重組人化抗體（全分子或或單克隆抗體片段）或者人類IgG的交叉反應(yīng)。這個單抗藥物代謝動力學(xué)電化學(xué)發(fā)光檢測有一個300–24，000 pg/mL的報道范圍，基于準(zhǔn)確度和精密度參數(shù)。在此工作中，釕標(biāo)記的親和純化兔抗單抗抗體和生物素化的血管內(nèi)皮生長因子被添加到血清樣品中。在臨床試驗中，單抗劑量患者的藥物代謝動力學(xué)評估需要高的檢測靈敏度。單抗，是一個重組人類Fab（“片段，抗原結(jié)合”），對血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)有高的結(jié)合親和力和特異性，抑制了它的活性。該方法已被應(yīng)用于檢測人類對照血清中的地高辛，得到了滿意的結(jié)果。108g/mL濃度范圍成良好的線性關(guān)系，1010g/mL。兩個免疫檢測平臺，一個是直接的均相免疫檢測抗地高辛抗體，一個是競爭免疫檢測地高辛。通過形成魯米諾BSA地高辛復(fù)合物標(biāo)記地高辛。漆紅蘭[64]等人報道了一種均相電化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法用于檢測小分子物質(zhì)。通用的非均相檢測系統(tǒng)在電極表面進行，需要孵育、