【文章內(nèi)容簡介】 聚法不同的是,在處理染菌的發(fā)酵液時仍可達(dá)到較好的處理效果。2. 3　轉(zhuǎn)化工藝無論是萊氏法還是二步發(fā)酵法制得的2 KLG,目前在生產(chǎn)上都是通過化學(xué)反應(yīng)過程轉(zhuǎn)化為VC。根據(jù)所選試劑的不同,二步發(fā)酵法可分為酸轉(zhuǎn)化法和堿轉(zhuǎn)化法。2. 3. 1　酸轉(zhuǎn)化法VC化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn),自萊氏法建立以來就采用濃鹽酸催化2 KLG ,一步制得VC。在以飽和氯代烴(如CHCl3 ) 、芳烴(如苯、甲苯)為溶劑,由2 KLG與濃鹽酸在60～75 ℃下反應(yīng)4～6 h ,可制得純度為90 %的粗VC。2 KLG 與濃鹽酸在表面活性劑Me(CH2 ) 5N +Me3Cl的甲苯溶液中反應(yīng),可制得純度超過99%的VC。2. 3. 2　堿轉(zhuǎn)化法我國VC生產(chǎn)廠家均采用堿法轉(zhuǎn)化2 KLG生產(chǎn)VC。東北制藥總廠等生產(chǎn)單位將2 KLG與甲醇在濃硫酸催化下生成2 酮基 L 古龍酸甲酯,該酯在NaHCO3 作用下發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)生成VC鈉鹽。該法避免了酸催化的上述缺點,且操作工藝簡單,反應(yīng)條件溫和,適合于規(guī)模化生產(chǎn),但是在生產(chǎn)中的反應(yīng)周期過長,甲醇單耗高。有些單位嘗試用CH3ONa代NaHCO3 進(jìn)行堿轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率可高達(dá)92. 6 % ,但產(chǎn)品質(zhì)量較差,且甲醇鈉價格貴,造成生產(chǎn)成本較高。國外學(xué)者對堿轉(zhuǎn)化的研究也一直在進(jìn)行。Bottcher等用丁醇代替甲醇,采用濃硫酸催化,在真空度0. 02MPa 、85 ℃的條件下與2 KLG進(jìn)行反應(yīng), 2 h后蒸去多余的丁醇及生成的水,向反應(yīng)體系中加入氯乙烯和鹽酸,在72～75 ℃加熱17 h,過濾后得到純度為98 %的VC。Veits用離子交換樹脂作催化劑,使2 KLG與甲醇的反應(yīng)液于80 ℃下在樹脂柱中停留10～120 min,然后將酯化液與NaHCO3 作用得到純度為98 %的粗VC鈉鹽。美國Fastman化學(xué)公司的研究人員將模擬流動床( SMB)反應(yīng)器應(yīng)用于該酯化反應(yīng),通過SMB反應(yīng)器脫水以促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行。Oklobdzu等通過二步酯化過程促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行,有效地實現(xiàn)了分離反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)過程中生成的水。由VC鈉鹽制備VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和樹脂交換法。硫酸酸化法操作簡單,但需妥善控制甲醇的濃度和pH值,才能使硫酸鈉與VC得以分離。氫型離子樹脂交換法設(shè)備龐大,操作復(fù)雜,且需經(jīng)常再生樹脂,增加了酸耗,酸液大量排放容易對環(huán)境造成威脅。目前,人們正在積極探索使用雙極性膜(BipolarMembrane Electrodial2ysis,BME)來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸化工藝,其工作原理為:在直流電場作用下, 雙極性膜中的水被離解成H+和OH ,H +替換VC鈉鹽中的Na +結(jié)合成離解度小的VC,原VC鈉鹽中的Na +在電場的作用下通過陽離子交換膜從VC鈉鹽中分離出來, 并和OH 結(jié)合生成NaOH。雙極性膜電滲析法無需外加物料可將VC鈉鹽轉(zhuǎn)化成VC,過程簡單,能耗低,投資少,轉(zhuǎn)化率高,其副產(chǎn)品和NaOH稀溶液也可被有效利用,對環(huán)境無污染,有望應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。三，維生素C的生物合成維生素C的生物合成途徑目前仍不完全清楚。目前研究表明，wheeler等唧提出的半乳糖途徑在植物維生素C的生物合成中占主導(dǎo)地位，但不能排除其它途徑的可能，尤其是已經(jīng)報道的糖醛酸衍生物可轉(zhuǎn)化為維生素C的現(xiàn)象。對擬南芥懸浮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)．植物體可以由葡萄醛酸甲酯和半乳糖醛酸甲酯合成維生素C[121。最近從草莓果實中克隆D一半乳糖醛酸還原酶基因．在擬南芥中表達(dá)可以使其維生素C含量提高2～3倍。這為糖醛酸作為維生素C合成底物提供了分子依據(jù)。把編碼L一古洛糖醛酸一1。4一內(nèi)酯氧化酶基因轉(zhuǎn)化到煙草和萵苣中可以使它們維生素C含量提高4～7倍．目前仍不清楚該酶是否可以對已知植物維生素C合成的底物L(fēng)一半乳糖醛酸一1．4一內(nèi)酯起作用．或者植物體本身可以產(chǎn)生L一古洛糖酸一l，4一內(nèi)酯j有人提出可能存在1個可以催化L一半乳糖醛酸一1，4一內(nèi)酯和L一古洛糖酸一l，4一內(nèi)酯相互轉(zhuǎn)化的3一C表異構(gòu)酶 。Wagnera等在研究維生素C代謝模式中發(fā)現(xiàn)在擬南芥中存在古洛糖酸，他們提出植物可能存在一個類似于動物的維生素C合成途徑。最近，Argelia等的研究認(rèn)為肌醇也能通過肌醇加氧酶的作用進(jìn)入糖醛酸途徑從而在植物體合成維生素C。迄今為止已經(jīng)有4種可能的植物維生素C合成途徑被提出即：半乳糖途徑、糖醛酸途徑、古洛糖途徑和肌醇途徑。 2合成路線中幾個重要問題的探討2．1菌種選育在維生素C生產(chǎn)路線研究中，高產(chǎn)菌株的篩選是實現(xiàn)工業(yè)化的關(guān)鍵，優(yōu)良的菌種對于維素C產(chǎn)量和經(jīng)濟效益的提高具有特殊重要意義。二步發(fā)酵法的第二步發(fā)酵是采用大菌、小菌2株菌的混合發(fā)酵過程，2株菌缺一不可。維生素C工業(yè)生產(chǎn)中常采用的小菌為氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)，大菌為巨大芽孢桿菌(BaciUusmegaterium)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereu)或條紋假單孢桿菌(Pseudemonasstritia)。研究發(fā)現(xiàn)，在大、小菌的混合培養(yǎng)中，兩者的增殖是同步進(jìn)行的。小菌是2KLG合成的主體，大菌一方面直接參與2KLG的合成過程，一方面對小菌的生長起促進(jìn)作用…。小菌合成的2KLG對大菌的生長增殖有明顯的抑制作用，而大菌的存在卻是小菌的生長增殖和合成2KLG所必需的。深入研究發(fā)現(xiàn)，大菌的胞內(nèi)液和胞外液均可促進(jìn)小菌的生長，大菌胞外液中具有該作用的組分的分子量在100kD以上。此外，胞外液還具有促進(jìn)小菌轉(zhuǎn)化I．山梨糖生成2．KLG的作用，具有該作用的組分包括30．50kD和大于100kD兩部分，其中前者系一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì)。二步發(fā)酵法第二步發(fā)酵過程的菌種選育一直是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)維生素c研究的熱點課題之一。為了克服傳統(tǒng)二步發(fā)酵法的缺點，人們開始嘗試構(gòu)建優(yōu)良的產(chǎn)2KLG工程菌。工程茵的構(gòu)建主要建立在人們對二步發(fā)酵法菌種相關(guān)關(guān)鍵酶的研究基礎(chǔ)之上。遺憾的是，這些研究均處于實驗室研究或小試階段。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開展了以葡萄糖作為直接發(fā)酵原料的研究。其中，美國AndersonS等人在證實了到棒狀桿菌中2，5一二酮基一D．葡萄糖酸(簡稱2，5DKG)的生物還原作用后，首先純化和鑒定了其中的還原酶，并測定了N末端的40個氨基酸順序，制備了合適的多核苷酸探針，分離得到2，5。二酮基D一葡萄糖酸還原酶基因，再繼續(xù)進(jìn)行基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建，將此載體