【正文】 siaeALOI基(D一阿拉伯糖．1。4．內酯氧化酶)和A．thaliana AGD基因(編碼L半乳糖1，4內酯脫氫酶)插入酵母的穿梭質粒中，然后加上強啟動子S．cerevisiae TPl。轉化到S．cerevisiae中，發(fā)現酵母不僅能在胞內積累VC，而且還能分泌到胞外。這一驚奇的發(fā)現促使他們繼續(xù)研究，將S．cerevisiae AL01基因和A．thaliana LGDH基因轉入S．cerevisiae中，結果發(fā)現，發(fā)酵6 d后，發(fā)酵液中VC達70 ms／L，酵母菌中仍含有vc 30 mg／L．L一半乳糖的轉化率達40％。酵母在有L半乳糖及衍生物存在的條件下，能夠自身合成VC，并能分泌到胞外，為工業(yè)生產VC開辟了一條新的道路。不過，酵母合成VC還存在一個難題。由于己一半乳糖及衍生物價格高，用其作為底物發(fā)酵生產VC因成本高，在工業(yè)上不可行。Branduardi等利用基因工程技術向S．cerev／shre中引入了3種關鍵酶，這3種酶能催化GDPD。甘露糖轉化成L_半乳糖，這樣就實現了利用酵母菌直接從D一葡萄糖生成VC。最后，他們成功得到了2株不同的菌株。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，在活性氧(Reactive oxygen species，ROS)低水平表達的情況下，酵母中有大量的VC積累，解決了底物問題。從此，利用酵母菌從D．葡萄糖生成VC的工業(yè)化生產將成為現實。2微藻合成VC微藻是人們研究合成VC的另一種真核微生物。與酵母菌不同的是，微藻中天然存在VC的合成途徑，能夠自身合成VC。Berry等。14 J提出了P．monform／s合成vC的途徑。D．葡萄糖代謝經過GDP．D一甘露糖，GDPL一半乳糖，L半乳糖和￡．半乳糖．1，4一內酯，L一半乳糖．1，4一內酯在L半乳糖．1，4脫氫酶的作用下脫氫生成VC。另外，微藻來源廣，價格也非常便宜，因此利用它來工業(yè)化合成VC是有可能的。Running等嘗試用異養(yǎng)綠微藻Chlorella pyrenoidosa一步發(fā)酵合成Vc，得到了40 mg／L的VC，產率非常低。后來，他們利用化學誘變劑對該微藻進行誘變育種，并對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，使VC的產率提高到了2/L，比原始菌株C．1ryrenoidosa UTEX 1663提高了70倍。不過，合成的VC主要集中在微藻細胞中，不利于VC的收集和大規(guī)模生產；但如果直接把微藻作為高營養(yǎng)的飼料和食品添加劑，則此方法就有很好的應用價值。Running等選取9株Prototheca monformis和43株Pro—thec speciesa進行vc合成研究，在它們的培養(yǎng)液中均有VC存在。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化后，VC在發(fā)酵液中的含量可以高達76 mg／L。利用誘變育種技術，得到1株Prototheca mori．加m厶ATCC 75669，不僅使VC合成量比原始菌有很大的提高，并且能分泌到胞外，證實了利用微藻工業(yè)化生產VC的可行性。微藻中VC合成途徑已經比較清楚了，利用基因工程技術來改造微藻，可進一步提高VC合成量，最終實現工業(yè)化大規(guī)模生產。但是相對于細菌和酵母來說，微藻生長緩慢，代謝不旺盛，因此，利用微藻發(fā)酵生產VC還需要進一步研究如何縮短生產周期。結言：萊氏發(fā)酵法是一種化學合成方法，其優(yōu)點是技術成熟、產品質量好、收率高，而且生產原料葡萄糖便宜易得。但是萊氏法有著致命的缺點，比如：生產工序過多，難以連續(xù)化操作，使用大量有毒、易燃化學藥品，容易造成嚴重環(huán)境污染等?！岸桨l(fā)酵法”是利用微生物發(fā)酵使L山梨糖轉化成2一酮基L古龍酸(2．KetoLgulonic acid，2KLG) 萊氏 。兩步發(fā)酵法與萊氏法進行同等生產規(guī)模的經濟指標比較，其優(yōu)缺點如下： （1）原料消耗 %。（2）成本 兩步發(fā)酵法原料成本比萊氏法降低了23．3％，工廠成本降低了3．6%。（3）質量 差別不大，在外觀、含量、烘烤消光值、分解點、細度等主要控制項目上，兩步發(fā)酵法略優(yōu)；但在加速破壞試驗中，萊氏法產品穩(wěn)定性較好。（4）能耗 兩步發(fā)酵法比萊氏法高出15％。（5）總收率（對山梨醇） 萊氏法比兩步發(fā)酵法高出10％左右，主要原因是第二步微生物氧收率仍較低。（6）安全 兩步發(fā)酵法由于革除了丙酮、苯（或甲苯）、氯氣等大量易燃易爆或有毒的化工原料，有利于安全生產。但“二步發(fā)酵法”不能完全脫離化學合成步驟，仍避免不了環(huán)境污染的問題。因此，近年來，有研究利用真核微生物來生物合成VC，期望能完全脫離化學合成步驟，減少環(huán)境污染。 酵母菌在工業(yè)生產上應用十分廣泛，人們對其特性非常了解，具有工業(yè)大規(guī)模生產的優(yōu)勢。首先，其營養(yǎng)要求低，生長快，培養(yǎng)基廉價，便于工業(yè)化生產；其次其具有強烈的好氧性，可進行細胞高密度培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細胞干重能達到120 g／L。因此，利用酵母發(fā)酵生產VC是一個很好的策略。雖然在酵母提取物中已發(fā)現VC的存在，但是，在自然條件下，酵母菌并不能合成VC，它只能合成一種VC類似物——D．紅抗壞血酸(Derythroaseorbie acid．D—EAA)。D—EAA和VC一樣具有還原性，但不具備VC的生物活性。 代別年代第一代第二代第三代第四代 表 2品種銷售額季度品種一品種二品種三合計甲乙150084574245512256874568296236356661237675875447994891565313合計2116015252152622926 總之，隨著科技的進步，在VC的工業(yè)生產中，生物合成藝將逐漸顯示出優(yōu)于化學合成工藝的特點?！岸桨l(fā)酵”法中生物合成的優(yōu)勢表現的非常明顯。所以，在“二步發(fā)酵”法投產后就很快取代了萊氏法的主導位置。目前，已經有大量研究關注細菌合成VC方法，但針對真核微生物中的研究還較少。酵母菌在工業(yè)中的廣泛應用，使其大規(guī)模發(fā)酵成為現實。今后的研究重點是利用基因工程技術來獲得適合工業(yè)生產的重組酵母菌。微藻自身能合成VC，價格低廉，來源廣泛，非常利于工業(yè)化生產，但還需對發(fā)酵條件、高濃度胞外分泌VC、如何加快生長速度等問題做進一步的研究。