【正文】 化為維生素C是兩個主要步驟。過去，維生素C的化學轉化均采用加酸轉化的方法，現(xiàn)在，國內已有約1／3以上的制藥廠采用了這種加堿轉化工藝，大大提高了產品的純度和精制收率，并且節(jié)水、節(jié)氣、節(jié)電，取得了較好的效益。只要能夠保證帶水醇蒸發(fā)的速度，單位時間里蒸發(fā)出的甲醇達到一定的量，酯化反應可以到底，減少甲酯的被破壞，這樣就能在保證收率的情況下提高質量。實驗中，帶水醇的蒸發(fā)是關鍵。結果證明，堿轉化3h就可以反應完全，并且縮短酯化時間對提高質量和收率都有好處。2．2酯化工藝維生素C合成中，從古龍酸到抗壞血酸鈉的轉化，經過一個可逆的酯化醇解反應【14】：文獻報道，醇解反應速度較快，一般2h即可充分反應。這只是簡單的基因克隆和載體的表達，實際上在細胞內的情況要復雜得多。其中，美國AndersonS等人在證實了到棒狀桿菌中2，5一二酮基一D．葡萄糖酸(簡稱2，5DKG)的生物還原作用后，首先純化和鑒定了其中的還原酶，并測定了N末端的40個氨基酸順序，制備了合適的多核苷酸探針，分離得到2，5。遺憾的是，這些研究均處于實驗室研究或小試階段。為了克服傳統(tǒng)二步發(fā)酵法的缺點，人們開始嘗試構建優(yōu)良的產2KLG工程菌。此外，胞外液還具有促進小菌轉化I．山梨糖生成2．KLG的作用，具有該作用的組分包括30．50kD和大于100kD兩部分，其中前者系一種含鐵和鋅的蛋白質。小菌合成的2KLG對大菌的生長增殖有明顯的抑制作用，而大菌的存在卻是小菌的生長增殖和合成2KLG所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，在大、小菌的混合培養(yǎng)中，兩者的增殖是同步進行的。二步發(fā)酵法的第二步發(fā)酵是采用大菌、小菌2株菌的混合發(fā)酵過程，2株菌缺一不可。迄今為止已經有4種可能的植物維生素C合成途徑被提出即：半乳糖途徑、糖醛酸途徑、古洛糖途徑和肌醇途徑。Wagnera等在研究維生素C代謝模式中發(fā)現(xiàn)在擬南芥中存在古洛糖酸，他們提出植物可能存在一個類似于動物的維生素C合成途徑。把編碼L一古洛糖醛酸一1。最近從草莓果實中克隆D一半乳糖醛酸還原酶基因．在擬南芥中表達可以使其維生素C含量提高2～3倍。目前研究表明，wheeler等唧提出的半乳糖途徑在植物維生素C的生物合成中占主導地位，但不能排除其它途徑的可能，尤其是已經報道的糖醛酸衍生物可轉化為維生素C的現(xiàn)象。雙極性膜電滲析法無需外加物料可將VC鈉鹽轉化成VC,過程簡單,能耗低,投資少,轉化率高,其副產品和NaOH稀溶液也可被有效利用,對環(huán)境無污染,有望應用到實際生產中。氫型離子樹脂交換法設備龐大,操作復雜,且需經常再生樹脂,增加了酸耗,酸液大量排放容易對環(huán)境造成威脅。由VC鈉鹽制備VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和樹脂交換法。美國Fastman化學公司的研究人員將模擬流動床( SMB)反應器應用于該酯化反應,通過SMB反應器脫水以促進酯化反應的進行。Bottcher等用丁醇代替甲醇,采用濃硫酸催化,在真空度0. 02MPa 、85 ℃的條件下與2 KLG進行反應, 2 h后蒸去多余的丁醇及生成的水,向反應體系中加入氯乙烯和鹽酸,在72～75 ℃加熱17 h,過濾后得到純度為98 %的VC。有些單位嘗試用CH3ONa代NaHCO3 進行堿轉化,轉化率可高達92. 6 % ,但產品質量較差,且甲醇鈉價格貴,造成生產成本較高。東北制藥總廠等生產單位將2 KLG與甲醇在濃硫酸催化下生成2 酮基 L 古龍酸甲酯,該酯在NaHCO3 作用下發(fā)生內酯化反應生成VC鈉鹽。2 KLG 與濃鹽酸在表面活性劑Me(CH2 ) 5N +Me3Cl的甲苯溶液中反應,可制得純度超過99%的VC。2. 3. 1　酸轉化法VC化學轉化生產,自萊氏法建立以來就采用濃鹽酸催化2 KLG ,一步制得VC。2. 3　轉化工藝無論是萊氏法還是二步發(fā)酵法制得的2 KLG,目前在生產上都是通過化學反應過程轉化為VC。 在用膜除蛋白的過程中,無任何新的化學物質加入,可減少對樹脂的污染和損耗,降低酸堿用量,減少三廢排放。2. 2. 3　超濾法超濾是一種新興的膜處理技術,此法具有操作方便、節(jié)能、不造成新的環(huán)境污染等優(yōu)點,因此在2 KLG的分離提純中的應用日益廣泛。但是,化學凝聚法也存在不足,主要表現(xiàn)在處理后的發(fā)酵液離心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白,如發(fā)酵液染菌則處理的效果更不明顯,上清液渾濁,嚴重影響產品的質量和收率。季光輝等采用化學凝聚法對VC發(fā)酵液進行預處理,使2 KLG的濾液質量提高,提取前步收率提高5. 2% , VC總收率提高2. 5%以上。兩次通過樹脂柱帶進了大量水分,也增大了濃縮耗能。此工藝通用氫型樹脂,調pH至蛋白質的等電點后加熱除蛋白。目前, VC工業(yè)生產中常用的2 KLG的分離提純方法有加熱沉淀法、化學凝聚法和超濾法。2. 2　提取工藝二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后,發(fā)酵液中僅含8 %左右的2 KLG,而殘留菌絲體、蛋白質、多糖或懸浮微粒等雜質的含量卻很高。劉禎等發(fā)現(xiàn)一株葡萄糖酸桿菌正向突變株,該菌株前期生長及產酸明顯高于生產菌株201C,經流加發(fā)酵工藝培養(yǎng),可縮短發(fā)酵周期8 h,山梨糖生成2 KLG的摩爾轉化率達80%。焦迎暉等通過分析VC二步發(fā)酵過程中活菌數(shù)、產酸量、pH值和糖酸轉化活力等,進一步證實了小菌具有將L 山梨糖轉化為2 KLG的能力,而大菌本身不產酸,其作用僅僅是通過刺激小菌的生長而促進小菌產酸。自二步發(fā)酵法發(fā)明推廣以來,國內外對該步的研究除了優(yōu)化發(fā)酵工藝外,主要集中在大、小菌的關系和優(yōu)良菌株的選育方面。近年來,國內外對這項工藝的研究甚少,研究方向主要集中在二步發(fā)酵法的第二步,即由L 山梨糖轉化為2 KLG。 混合發(fā)酵2. 1　發(fā)酵工藝二步發(fā)酵法的生物轉化過程如下: 　D 山梨醇　黑醋酸菌　L 山梨糖該法以生物氧化過程代替萊氏路線中的部分純化過程,簡化了生產工藝,降低了生產成本,減少了“三廢”污染,多年以來一直被國內廠家使用。由于生產原料廉價易得,中間產物的化學性質穩(wěn)定,但是萊氏法也存在不少缺陷,諸如生產工序多、勞動強度較大,使用大量有毒、易燃化學藥品,容易造成環(huán)境污染等。該法以葡萄糖為原料,經催化加氫制取D 山梨醇,然后用醋酸菌發(fā)酵生成L 山梨糖,再經酮化和化學氧化,水解后得到2 酮基 L 古洛糖酸(2 KLG) ,再經鹽酸酸化得到VC。所以維