【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ↓ 重新接種 于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) 1）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ↓ 培養(yǎng) 2）懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代 直接傳代法 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 800g）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除 l／ 2一 2／ 3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 （三）細(xì)胞純化 （四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇 ?細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。 凍存意義： 1）長(zhǎng)期保存細(xì)胞； 2）防止細(xì)胞老化； 3）減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 ? 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 ? 在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分， 減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。 ? 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。 ? 復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 保存細(xì)胞三要素：營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)劑和低溫 低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 ? 在細(xì)胞凍存時(shí)加入保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 ? 常用的低溫保護(hù)劑是 甘油或 DMSO，滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。 ? 保護(hù)劑的濃度在 5~15%之間，常用 10%。 慢凍程序 ? 標(biāo)準(zhǔn)程序： ? 當(dāng)溫度在 25 ℃ 以上時(shí)， 1～ 2 ℃ /min ? 當(dāng)溫度達(dá) 25 ℃ 以下時(shí)， 5～ 10 ℃ /min ? 當(dāng)溫度達(dá) 100℃ 時(shí)，可迅速放入液氮中 ? 簡(jiǎn)易程序： ? 將冷凍管 （ 管口要朝上 ） 放入紗布袋內(nèi) ， 紗布袋系以 線繩 ，通過(guò)線繩將 紗布袋固定于液氮罐罐口 ， 按每分鐘溫度下降 1～ 2 ℃ 的速度 ， 在 40分鐘內(nèi)降至液氮表面 ， 停 30分鐘后 ， 直接投人液氮中 。 細(xì)胞凍存方法 1預(yù)先配制凍存液： 含 20%血清培養(yǎng)基 9份 DMSO 1份 2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細(xì)胞 /ml) 3 分裝：每瓶 1ml，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名 稱和冷凍日期。 凍存 1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于 4℃ 10分鐘 → 20℃ 30分鐘 → 80℃ 16～ 18小時(shí) (或隔夜 )→ 液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 20℃ 不可超過(guò) 1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入 80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以 1～ 3℃ /分鐘之速度由室溫降至 (80℃ 以下 )120℃ ，再放在液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與 hybridoma之保存。 ?凍存要點(diǎn)： 1）慢凍 2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行凍存，無(wú)微生物污染； 3）細(xì)胞濃度：達(dá)到 10 6/毫升 4）合適的冷凍保護(hù)劑： DMSO,常用 10%。 5）使用高濃度血清 細(xì)胞復(fù)蘇方法 ? 與快速融化的手段 ， 以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化 ， 避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害 。 ? 程序： （ l） 從液氮中取出冷凍管 ， 迅速投入 37～ 38 ℃ 水浴中 ， 使其融化 （ 1分鐘左右 ） 。 （ 2） 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 （ 3） 低速離心 10分鐘 。 （ 4） 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞 。 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 ? 懸滴培養(yǎng)法 ? 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ? 灌注小室培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 ? 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 ? 克隆培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法 ? 懸滴培養(yǎng)法：又稱植塊懸滴培養(yǎng)法， 1907年，哈里森首創(chuàng)。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營(yíng)養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 1）容易換片。 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中，不需移動(dòng)位置，有利于組織分化。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ? 蓋爾（ Gey， 1933年）、劉易斯（ Lewis， 1934年）建立該方法。 ? 特點(diǎn)：是培養(yǎng)中組織塊或細(xì)胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。包括旋轉(zhuǎn)管、旋轉(zhuǎn)鼓、支架等。 ? 缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。 灌注小室培養(yǎng)法 ? 在蓋玻片懸滴法基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，可用于連續(xù)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，研究各種因素影響作用及活細(xì)胞反應(yīng)。 1912年由Burrows首創(chuàng)。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 ? 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法：指將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。 ? 1923年，卡雷爾（ Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶。 Earle設(shè)計(jì)了 T培養(yǎng)瓶。采用的材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，透明。 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶 滾動(dòng)培養(yǎng)瓶 ? 蓋玻片 +培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：先以蓋玻片為生長(zhǎng)表面，將擬培養(yǎng)細(xì)胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響 2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存； 3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱微量培養(yǎng)法。 ? 一般是一次性使用 克隆培養(yǎng)法 就是將細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù) 過(guò)程 : 制細(xì)胞懸液 連續(xù)稀釋獲得單細(xì)胞 單細(xì)胞接種 培養(yǎng) 細(xì)胞株 :由細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得的由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。 三 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器、人工灌流技術(shù)等發(fā)展起來(lái)的。 （一）培養(yǎng)方法 ? 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) ? 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) ? 懸浮培養(yǎng)技術(shù) ? 微載體培養(yǎng)技術(shù) ? 多孔載體培養(yǎng) ? 微囊化培養(yǎng)技術(shù) ? 中空纖維法 固定化培養(yǎng) 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) ? 此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動(dòng)，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，故多用于 制備用量較小、價(jià)值高的生物藥品。 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 適于少數(shù)懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞 微載體培養(yǎng)技術(shù) ? 1967年， Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以直徑 60250um微珠作為微載體。 ? 原理：其原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒 微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。 ? 理想的細(xì)胞支持物特征 ：生物相容性；無(wú)毒害；好的傳質(zhì)特征；機(jī)械穩(wěn)定性好；比表面大，適于細(xì)胞生長(zhǎng)；顆粒均一；能高壓滅菌；可重復(fù)利用，易清洗；接種方便；能固定大部分細(xì)胞，能保護(hù)細(xì)胞，易使細(xì)胞、載體和培養(yǎng)基分離；適合貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具體步驟 p110 選擇合適的微載體類型 浸泡水化及消毒 接種 培養(yǎng)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù) 消化 分離細(xì)胞 傳代培養(yǎng) 交聯(lián)葡萄糖 DEAE纖維素 蛋白質(zhì)：變性膠原 高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯 無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì) 常用商品化微載體有三種： Cytodex 3， Cytopore和Cytoline。 ?多孔載體培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：易固定化、比表面大、細(xì)胞在載體內(nèi)生長(zhǎng)，免受機(jī)械損傷；可以提高通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。 多孔載體材料要求：生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性 微囊化培養(yǎng)技術(shù) ? 人造的半透膜制成的多孔微球體，借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊內(nèi)。適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。 ? 微囊直徑控制在 200400μm為宜。 ? 制備中應(yīng)注意： ? 溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作； ? 所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害； ? 膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)； ? 膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。 中空纖維法 ? Richard Kncazek 1972年發(fā)明。最初使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。 ? 可以模擬細(xì)胞體內(nèi)三維狀態(tài)。 ? 目前材料有：硅膠、聚丙烯等。 ? 優(yōu)點(diǎn)是： 占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá) 109數(shù)量級(jí)； 生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 （二）動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)（ ※ ） 生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析 反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)形式： 攪拌式 氣升式 固定床式 技術(shù)要求：能提供均勻溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，傳質(zhì)效果好；反應(yīng)器空間利用率高，選用合適載體系統(tǒng)和材料；能保證嚴(yán)格無(wú)菌；能控溫、酸堿、溶氧和 CO2濃度等；能方便快捷實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液連續(xù)添加，樣品采集和觀察。 生物反應(yīng)器應(yīng)用概況 * 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用的生物反應(yīng)器： ? 柱狀中空纖維反應(yīng)器 ? 板框式中空纖維反應(yīng)器 ? 中心灌流式反應(yīng)器 ? 灌流微載體生物反應(yīng)器 ? 旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器 （三）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。 缺點(diǎn)：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大 的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低 . 優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長(zhǎng)期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下 生長(zhǎng)。 缺點(diǎn)：開放式操作，容易造成污染。細(xì)胞容易發(fā)生變異，且對(duì) 設(shè)備等要求高。 優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長(zhǎng)。產(chǎn)量高等 . （四）、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) 產(chǎn)品 應(yīng)用 ? 病毒疫苗：乙肝、脊椎灰質(zhì)炎和狂犬疫苗等 ? 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白細(xì)胞介質(zhì)、 B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨噬細(xì)胞激活因子、 T細(xì)胞替代因子等 ? 多態(tài)生長(zhǎng)因子：神經(jīng)、成纖維、表皮、血清生長(zhǎng)因子等 ? 酶類：組織血纖維酶原激活劑 ? 激素：紅細(xì)胞