【文章內(nèi)容簡介】 胞凈化消除。 污染的預防和消除一、動物細胞工程史二、動物細胞的特點三、動物細胞培養(yǎng)方法四、影響動物細胞生長的環(huán)境因素五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)六、組織工程七、器官培養(yǎng)八、干細胞四、影響動物細胞生長的環(huán)境因素五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)216。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)是指在人工條件下，在生物反應器(bioreater)培養(yǎng)系統(tǒng)高密度大量培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)生物制品，再通過相關(guān)的純化手段濃縮純化其產(chǎn)物的技術(shù)。動、植物細胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的比較比較項目 微生物 哺乳動物細胞 植物細胞大小 1－ 10μ m 10－ 100μ m 10－ 100μ m懸浮生長 可以 多數(shù)細胞需貼 壁生長 可以，但易成團，無單個細胞營養(yǎng)要求 簡單 非常復雜 較復雜生長速率 快，倍增時間 為 慢，倍增時間為 15－ 100小時 慢，倍增時間為 24－ 74小時代謝調(diào)節(jié) 內(nèi)部 內(nèi)部、激素 內(nèi)部、激素動植物細胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的比（續(xù)）比較項目 微生物 哺乳動物細胞 植物細胞環(huán)境敏感性 能忍受廣泛范圍 非常敏感，僅忍受很窄范圍 能忍受廣泛范圍細胞分化 無 有 有剪切力敏感 低 非常高 高傳統(tǒng)變異、篩選技術(shù) 廣泛使用 不常使用 有時使用細胞或產(chǎn)物濃度 較高 低 低216。對結(jié)構(gòu)復雜，二硫鍵多，并且翻譯后的修飾對蛋白活性的影響很大的蛋白，采用原核表達系統(tǒng)往往不能滿足蛋白表達的需要216。許多用于防治人類疾病的糖蛋白，原核細胞根本無法表達。216。新生物技術(shù)藥物： 哺乳動物細胞表達的重組蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上保持很高的一致性 。為何還要構(gòu)建以哺乳動物為代表的真核細胞表達系統(tǒng)呢？：乙肝疫苗、狂犬疫苗、脊椎灰質(zhì)炎疫苗疫苗主要成分為免疫性蛋白質(zhì)，通常與基因技術(shù)相結(jié)合，將能表達特定免疫蛋白的基因轉(zhuǎn)入合適的動物細胞進行高效表達和實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)相應的疫苗產(chǎn)品。實例? 乙肝基因工程 (CHO)疫苗 :用基因工程技術(shù)將乙型肝炎表面抗原基因片段重組到中國倉鼠卵巢細胞(CHO)內(nèi)，通過對細胞培養(yǎng)增殖，增殖分泌乙肝表面抗原 (HBsAg)于培養(yǎng)液中，經(jīng)純化后制成。 (美國 Genentech公司應用 SV40為載體)? Vero細胞 (非洲綠猿猴色腎細胞） 和狂犬病毒：Vero細胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應器接種狂犬病毒出液口收獲病毒：干擾素（ IFN)、 白細胞介素（ IL）、 B細胞生長因子（ BCGF）、 巨噬細胞激活因子（ MAN） 等英國 Welle公司采用 8000LNamalwa細胞生產(chǎn) α干擾素。英國 Celltech公司用氣升式生物反應器生 α、 β和 γ干擾素；干擾素 是一種在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白，具有抑制病毒的作用，但不能殺滅病毒。作用機制：作用于細胞后使細胞產(chǎn)生多種其他蛋白，從而阻斷病毒復制過程。自 1975年發(fā)現(xiàn)干擾素以來，經(jīng)歷了自然干擾素（白細胞干擾素、成纖維干擾素和 T細胞干擾素）、基因重組干擾素和蛋白質(zhì)工程干擾素三個主要階段。 MCAB：雜 交瘤 細 胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量 單 克隆抗體 。它具有特異性強、能夠大量生產(chǎn)的兩大顯著優(yōu)點。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體是一種經(jīng)濟、可靠的途徑。英國 Celltech公司用無血清培養(yǎng)液在 10000L氣升式生物反應器中培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。 ? 把鼠抗體的 CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)， 使之接近于人類抗體的天然結(jié)構(gòu)，從而消除了 人體免疫系統(tǒng)對鼠源性單克隆抗體的免疫反應。 ? 人源化單克隆抗體 “泰欣生 ”，人源化程度達到 95%CDR移植技術(shù) (單克隆抗體人源化 )：? ： 神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、血清生長因子（ 美國 Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)出免疫球蛋白 G、 A、 M和尿激酶、人生長激素等。 ） ? ： 紅細胞生成素、促黃體生成素? :癌胚抗原 (CEA)癌胚抗原 (CEA)是首先在結(jié)腸癌病人的血清中發(fā)現(xiàn)的一種球蛋白，在胎兒 3－ 6個月的血清中可以檢測到，所以稱作癌胚抗原。目前我國批準上市的哺乳動物細胞尤其是CHO細胞表達的產(chǎn)品很少，只有 促紅細胞生成素 （ EPO）、 CHO基因工程 乙肝疫苗 、以及 治療性抗體藥物 益賽普 （有效成分相當于美國食品藥品管理局批準的 Enbrel） 和 泰欣生 （ 有效成分相當于美國食品藥品管理局批準的 Erbitux） 等少數(shù)幾種生物技術(shù)藥物；美國 FDA在 2022年 1月 ~2022年 12月批準上市的 31種生物技術(shù)藥物中，約 70%為哺乳動物細胞表達的重組蛋白?，F(xiàn) 狀? 哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)百泰的發(fā)酵系統(tǒng)由瑞士制造? 生物反應器? 反應器工藝流程? 發(fā)展趨勢動物細胞培養(yǎng)生物反應器設計依據(jù)生物反應器種 類 ： 浮培養(yǎng)用反 應 器：如 攪 拌反 應 器 、中空 纖維 反 應 器、陶 質(zhì) 矩形通道蜂 窩 狀反 應 器、 氣升式反 應 器； 壁培養(yǎng)用反 應 器：如 攪 拌反 應 器（微 載 體培養(yǎng)）、玻璃珠床反 應 器、中空 纖維 反 應 器、陶 質(zhì) 矩形通道蜂 窩 狀反 應 器； 應 器：如流化床反 應 器、固化床反 應 器。 反應器工藝流程? 分批培養(yǎng) （ batchculture） ? 流加式培養(yǎng) （ fedbatchculture）? 半連續(xù)培養(yǎng) （ semicontinuousculture）? 連續(xù)培養(yǎng) （ continuousculture）? 灌流式 （ perfusionculture）（ batchculture） ：一次性轉(zhuǎn)入 生物反應器 ， 在培養(yǎng)過程中體積不變，不添加其它成分，一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。 特點：?操作 簡單 ； 培養(yǎng)周期短，染菌和 細 胞突 變 的 風險 小。?直 觀 反映 細 胞生 長 代 謝 的 過 程；?可直接放大。216。 常用攪拌式生物反應器分批式培養(yǎng)單抗 ,采用微囊或巨載體培養(yǎng)。216。 美國 Genentech使用 CHO細胞以 12,000L培養(yǎng)槽生產(chǎn) tPA重組蛋白以及治療癌癥的生物藥物 組織型纖維 蛋白 溶酶原激活物 (tPA)和 重組 型纖維 蛋白 溶酶原激活物 (rtPA). 攪拌式生物反應器 ： 懸浮培養(yǎng)，根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求， 流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基 ，當細胞核產(chǎn)物達所需指標，一次性取出。特點：? 細胞培養(yǎng)時間較長，總密度較高，產(chǎn)物濃度較高。? 流加培養(yǎng)過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環(huán)境變化時的瞬間行為。? 可采用工藝參數(shù)的直接放大。是當前主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，關(guān)鍵技術(shù)是基礎培養(yǎng)基和流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。半連續(xù)式培養(yǎng) ： 懸浮培養(yǎng)形式 ， 每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應器內(nèi)的總體積不變。特點：? 培養(yǎng)物的體積逐步增加 ， 細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。? 可進行多次收獲 ， 長時期進行生產(chǎn)；? 細胞可持續(xù)