細(xì)胞工程-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理(編輯修改稿)
2025-02-12 16:46 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 時(shí)間長，容易污染） → 對(duì)某些軟組織碎 組織塊，可放入注射器玻璃管中或 1mm不銹鋼 /尼龍網(wǎng)篩擠壓分離。 （二）組織消化 (tissue digestion) 用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。 常用消化液適用范圍 （ 1） 胰蛋白酶： 適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、腎、傳代細(xì)胞等。 （ 2） 膠原酶： 適用于纖維組織、上皮組織、癌組織等。 （ 3） 其他酶： 鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等，根據(jù)酶的作用特點(diǎn)及組織成分不同適當(dāng)選用 （ 4） EDTA： 最適于消化傳代細(xì)胞時(shí)，常與胰蛋白酶配合使用。 組織消化操作方法 (tissue digestion method of operation) （ 1）胰蛋白酶消化 (trypsin digestion) ① 將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶中，加入 30~50倍體積的 %胰 蛋白酶； ② 37℃ 水浴內(nèi)消化 30~60min，每 5~10min搖動(dòng)一次。根據(jù)效果可中間更換消 化液。（靜止 10min，吸去 2/3上清液，補(bǔ)加新鮮胰蛋白酶） ③ Hanks液漂洗兩次，每次 2~3min； ④ 800r/min離心 5min，棄上清液，加入營養(yǎng)液。如有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。 如消化傳代細(xì)胞，可與 EDTA混用。 （ 2）膠原酶消化 (collagenase enzymatic digestion ) ① 培養(yǎng)瓶中放入 1~5mm3大小的碎組織塊，加 5ml 2023 u/ml的膠原酶溶液，使終濃度為 200u/ml， ； ② ℃ 水浴 24~48h，視情況可適當(dāng)延長，無需搖動(dòng)。期間可更換酶液一次； ③見組織塊已變軟，分散于瓶底時(shí)，輕微震蕩使散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。小心倒出培養(yǎng)液，瓶底可能附著一些巨噬細(xì)胞，借此可將其分開（單獨(dú)培養(yǎng)或棄之不用）； ④ 800r/min離心 5min，棄上清液，重懸于 BSS液中，再重復(fù)離心一次； ⑤加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用于接種。 三、細(xì)胞計(jì)數(shù) (cell counting) ——計(jì)數(shù)懸浮液中細(xì)胞的形態(tài)及濃度，以判斷消化或稀釋程度（亦用于培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度的檢查） ① 染色 ：在干凈的離心管中加入 9滴細(xì)胞懸液，再加入 1滴 %臺(tái)盼藍(lán)，混勻，靜置 2~3min； ② 充池 ：在計(jì)數(shù)板蓋片邊緣加入 1~2滴染色的細(xì)胞懸液，使之完全充滿計(jì)數(shù)板與蓋玻片間的空間（無氣泡或溢出） ③ 計(jì)數(shù)： 在顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板四角四個(gè)大方格中的活細(xì)胞（不染色細(xì)胞）總數(shù)。一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。壓線細(xì)胞，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。 ④ 計(jì)算 ： 細(xì)胞懸液濃度（細(xì)胞個(gè)數(shù) /ml） =（ 4大格細(xì)胞總數(shù) /4） 104稀釋倍數(shù) 注意 ：如細(xì)胞團(tuán)數(shù)超過 10%，說明消化不充分。 細(xì)胞接種濃度： 3~10 105/ml 四、常用培養(yǎng)法 (general cultivation) （一）組織塊培養(yǎng)法 ( tissue piece cultivation) 將組織塊剪切成小塊，直接放入培養(yǎng)瓶中，貼附一段時(shí)間后，細(xì)胞從組織塊長出，最終形成單層細(xì)胞。 懸滴培養(yǎng)法 (drop culture)——最簡(jiǎn)單、最原始的培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法缺點(diǎn)：細(xì)胞生長空間狹小氣體不足，不能持續(xù)長時(shí)間生長培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基凹玻片折光，不便于觀察。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 (rotate tube culture) ① 組織塊或細(xì)胞可交替地接觸營養(yǎng)液和空氣，利于細(xì)胞生長； ②培養(yǎng)管緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，使整個(gè)管內(nèi)壁全部長滿細(xì)胞，提高了細(xì)胞產(chǎn) 量，適于較大量的組織培養(yǎng)和各種長期傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。 缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。 灌注小室培養(yǎng)法 (dabble booth cultivation) 為大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)提供了參考原理。 卡氏瓶培養(yǎng)法 卡氏瓶 (carlsberg39。s flask)（如下圖）： ①將組織塊剪碎， BSS漂洗。 ②轉(zhuǎn)移到另一只培養(yǎng)皿，在解剖顯微鏡下去掉不需要的組織如脂肪、壞死組織等。將組織塊切成 1mm3小塊。 ③用預(yù)先潤濕的滴管轉(zhuǎn)移到消毒離心管，靜置使組織小塊下沉，吸去上清。以新鮮 BSS漂洗。重復(fù) 2~3次。 ④ 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶（每個(gè) 25ml的培養(yǎng)瓶可放置 20~30塊組織小塊），吸去液體。加入1ml生長培養(yǎng)液，輕斜擺動(dòng)培養(yǎng)皿，使組織小塊均勻分布。蓋好瓶蓋， ℃ 培養(yǎng)18~24h。 ⑤待組織塊粘附瓶壁后 3~5天，加入 5ml培養(yǎng)液；然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng) 3~5周，細(xì)胞不斷增長，肉眼或低倍鏡下觀察可見圍繞組織周圍生長猶如日暈，稱“ 生長暈 ”。 ⑥取出中央組織塊，用預(yù)先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶。重復(fù)④ ~⑥ 操作。 ⑦在原生長暈培養(yǎng)瓶內(nèi)換入新鮮培養(yǎng)液。待生長暈細(xì)胞擴(kuò)展至約 50%培養(yǎng)瓶底表面時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 （二）單層細(xì)胞培養(yǎng)法 ( monolayer method) 組織塊經(jīng)胰酶消化分散成較小的細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，在合成培 養(yǎng)液中附在瓶壁上長成單層，即形成所謂單層細(xì)胞培養(yǎng)。 原代培養(yǎng) (primary culture)（初代培養(yǎng)） 傳代培養(yǎng) (serial subcultivation) : 傳代的理想時(shí)期：對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞 80~90%或剛剛?cè)繀R合。 方法： ① 消化 ：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶與 EDTA混合液，蓋滿瓶底，
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